BlueKit dsRNA ELISA 检测试剂盒采用双抗夹心法定量检测样本中双链 RNA(dsRNA) 含量,检测的 dsRNA 长度 60 bp 及以上 , 检测的 dsRNA 与其核酸序列无关。柏莱源生物为谱新生物代理商,具体产品价格与技术问题等信息咨询,请联系我们!
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货号:HG-DS001
产品简介:
本试剂盒采用双抗体夹心法原理,并偶联生物i素-链霉亲和素系统,用于定量检测样本中双链RNA(dsRNA)含量,检测的dsRNA 长度60 bp 及以上, 检测的dsRNA 与其核酸序列无关。酶标板微孔中包被抗dsRNA 抗体,加入样本后孵育洗涤,再加入生物i素化检测抗体孵育,形成抗体-抗原-抗体复合物,再次洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记链霉亲和素(streptavidin,SA)。经过彻-底洗涤后加底物TMB显色,TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中dsRNA 含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),根据标准曲线计算样品中dsRNA浓度。
(1)检测范围:
无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 检测线性范围0.0156-0.5pg/μL
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 检测线性范围0.0312-1pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA检测线性范围0.0625-1pg/μL
(2)检测限:
无-修饰、pUTP修饰、N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 检测限 0.001pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 检测限0.01pg/μL
(3)定量限:
无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 定量限0.0156pg/μL
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 定量限0.0312pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 定量限0.0625pg/μL
(4)精密度:CV%≤10%
(5)回收率:80%~120%
96T
适用于定量检测样本中dsRNA 的含量。
组分 | 规格 | 配制 |
包被酶标板(Coated Plate) | 8×12条 | 即用型 |
生物i素化检测抗体(100×Detec Antibody) | 120μL×1管 | 用稀释液作100倍稀释 |
HRP-链霉亲和素(100×Streptavidin-HRP) | 120μL×1管 | 用稀释液作100倍稀释 |
稀释液(Diluent Buffer) | 30mL×1瓶 | 即用型 |
显色液(TMB Substrate) | 12mL×1瓶 | 即用型 |
终止液(Stop Solution) | 6mL×1瓶 | 即用型 |
20×洗涤液(20×Wash Buffer) | 40mL×1瓶 | 用纯水按1:19体积比稀释成洗涤工作液 |
无-修饰dsRNA标准品(No modificatiφn Standard,5ng/μL) | 15μL×1管 | 用STE buffer稀释至所需浓度 |
PUTP修饰dsRNA标准品(pUTP modification Standard,5ng/μL) | 15μL×1管 | 用STE buffer稀释至所需浓度 |
N1-Me-pUTP修饰dsRNA标准品(N1-Me-pUTP modification Standard,5ng/μL) | 15μL×1管 | 用STE buffer稀释至所需浓度 |
5-OMe-UTP修饰dsRNA标准品(5-0Me-UTP modification Standard,5ng/μL) | 15μL×1管 | 用STE buffer稀释至所需浓度 |
STE缓冲液(STE buffer) | 50mL×1瓶 | 即用型 |
封板膜(Sealer Film) | 5张 | 即用型 |
说明书 | 1份 | 即用型 |
备 注:未开封试剂盒,在2~8℃条件下有效期为12个月。
◆酶标仪
◆去离子水
◆微孔板恒温振荡器
◆全新滤纸
◆微量移液器及吸头
◆涡旋振荡器
实验前准备
1.将本次实验所用试剂平衡至室温(18~25°C)。
2.20×浓缩洗涤液用纯化水按1:19 体积比稀释成洗涤工作液。
3.将抗体管、HRP-SA 管和标准品管1000 rpm在使用前离心30s,以避免管壁及管盖上残留试剂。
4.将100×生物i素化检测抗体和100×HRP-链霉亲和素在使用前用稀释液作100 倍稀释后使用。
5. 无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer稀释至1 、0.5 、0.25 、0.125 、0.0625 、0.0312 、0.0156、0 pg/μL。
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer 稀释至2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0 pg/μL。
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer 稀释至4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 pg/μL
标准品稀释方法建议如下:
a).无-修饰、 pUTP 修饰
编号 | 终浓度 (pg/μL) | 稀释方法 | |
STE buffer | 工作标准品 | ||
100 | 49μL | lμL5ng/μL标准品 | |
A | 1 | 495μL | 5μL100 pg/μL溶液 |
B | 0.5 | 250μL | 250μLA溶液 |
C | 0.25 | 250μL | 250μLB溶液 |
D | 0.125 | 250μL | 250μL C溶液 |
E | 0.0625 | 250μL | 250μLD溶液 |
F | 0.0312 | 250μL | 250μLE溶液 |
G | 0.0156 | 250μL | 250μLF溶液 |
H | 0 | 250μL | / |
编号 | 终浓度 (pg/μL) | 稀释方法 | |
STE buffer | 工作标准品 | ||
100 | 49μL | 1μL 5ng/μL标准品 | |
A | 2 | 495μL | 10μL 100 pg/μL溶液 |
B | 1 | 250μL | 250μLA溶液 |
C | 0.5 | 250μL | 250μLB溶液 |
D | 0.25 | 250μL | 250μL C溶液 |
E | 0.125 | 250μL | 250μLD溶液 |
F | 0.0625 | 250μL | 250μLE溶液 |
G | 0.0312 | 250μL | 250μLF溶液 |
H | 0 | 250μL | / |
编号 | 终浓度 (pg/μL) | 稀释方法 | |
STE buffer | 工作标准品 | ||
100 | 49 μL | 1μL 5ng/μL标准品 | |
A | 4 | 480 μL | 20μL 100 pg/μL溶液 |
B | 2 | 250 μL | 250μL A溶液 |
C | 1 | 250 μL | 250μL B溶液 |
D | 0.5 | 250 μL | 250μL C溶液 |
E | 0.25 | 250 μL | 250μL D溶液 |
F | 0.125 | 250 μL | 250μL E溶液 |
G | 0.0625 | 250 μL | 250μL F溶液 |
H | 0 | 250 μL | / |
操作步骤
(1)从室温(18-25℃)平衡后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条加盖封板膜后用自封袋密封放回2~8℃。
(2)设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加入不同浓度的标准品100μL,样本孔中加入待测样本100μL。
*当不能够确定待测样品中的dsRNA含量时,应当用STE buffer 做多个稀释倍数做检测,以免含量过高不能够读取有效数值。
(3)用封板膜封住反应孔,室温(18-25℃)下振板(500rpm)反应60min。
(4)弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(250μL),静置30s,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次。
(5)标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的生物i素化检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,室温(18-25℃)下振板(500rpm)反应60min。
(6)弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(250μL),静置30s,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4 次。
(7)标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的HRP-链霉亲和素100μL,用封板膜封住反应孔,室温(18-25℃)下振板(500rpm)反应30min。
(8)弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(250μL),静置30s,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4次。
(9)每孔加入单组分底物显色液100μL,用封板膜封住反应孔,室温(18-25℃)静置避光反应30min。
(10)每孔加入终止液50μL,立即进行检测,设定酶标仪波长于450nm处( 建议用双波长450nm/650nm)。
结果处理
1.标准曲线
2.实验检测结果
抗原浓度 (pg/μL) | N1 - Me - pUT P修饰标准品 | ||
OD(1) | OD(2) | 平均值 | |
2 | 2.8412 | 2.7362 | 2.7887 |
1 | 1.8725 | 1.9135 | 1.8930 |
0.5 | 1.0863 | 1.1207 | 1.1035 |
0.25 | 0.623 | 0.6055 | 0.6143 |
0.125 | 0.3388 | 0.3292 | 0.3340 |
0.0625 | 0.1947 | 0.1885 | 0.1916 |
0.0312 | 0.1192 | 0.1247 | 0.1220 |
0 | 0.0567 | 0.0518 | 0.0543 |
1.显色温度和时间对实验结果至关重要,应准确把握。
2.洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板30s后再甩干,以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3.所有试剂使用前应充分摇匀,加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部,避免加在孔壁上部,加样时注意不可溅出,不可产生气泡。
4.若发现浓缩洗涤液中有结晶,可在37℃水浴锅中孵育,待结晶完-全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5.样本中应避免引入叠氮-化钠(NaN3),叠氮-化钠会破坏辣根过氧化酶活性,使检测值偏低。
6.实验操作过程中要严格避免RNase污染。
7.不可使用摇床代替振板机,若无振板机可采用室温(18-25℃)静置孵育,但静置孵育会造成检测灵敏度下降一倍左右。建议无-修饰、pUTP修饰标准品从2pg/μL开始稀释,N1-Me-pUTP 修饰标准品从4pg/ μL开始稀释,5-OMe-UTP修饰标准品从8pg/μL 开始稀释,HRP-SA孵育时长由30min 调整至60min。
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