dsRNA ELISA  检测试剂盒说明书

货号：HG-DS001

产品简介：

本试剂盒采用双抗体夹心法原理，并偶联生物i素-链霉亲和素系统，用于定量检测样本中双链RNA(dsRNA)含量，检测的dsRNA 长度60 bp 及以上, 检测的dsRNA 与其核酸序列无关。酶标板微孔中包被抗dsRNA 抗体，加入样本后孵育洗涤，再加入生物i素化检测抗体孵育，形成抗体-抗原-抗体复合物，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记链霉亲和素(streptavidin，SA）。经过彻-底洗涤后加底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中dsRNA 含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，根据标准曲线计算样品中dsRNA浓度。

（1）检测范围：
无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 检测线性范围0.0156-0.5pg/μL
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 检测线性范围0.0312-1pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA检测线性范围0.0625-1pg/μL
（2）检测限：
无-修饰、pUTP修饰、N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 检测限 0.001pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 检测限0.01pg/μL
（3）定量限：
无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 定量限0.0156pg/μL
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 定量限0.0312pg/μL
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 定量限0.0625pg/μL
（4）精密度：CV%≤10%
（5）回收率：80%~120%

规格：

96T

应用：

适用于定量检测样本中dsRNA 的含量。

试剂盒组成：

备 注:未开封试剂盒，在2~8℃条件下有效期为12个月。

需自行准备的材料

◆酶标仪

◆去离子水

◆微孔板恒温振荡器

◆全新滤纸

◆微量移液器及吸头

◆涡旋振荡器

实验前准备

1.将本次实验所用试剂平衡至室温（18~25°C）。

2.20×浓缩洗涤液用纯化水按1：19 体积比稀释成洗涤工作液。

3.将抗体管、HRP-SA 管和标准品管1000 rpm在使用前离心30s，以避免管壁及管盖上残留试剂。

4.将100×生物i素化检测抗体和100×HRP-链霉亲和素在使用前用稀释液作100 倍稀释后使用。

5. 无-修饰、pUTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer稀释至1 、0.5 、0.25 、0.125 、0.0625 、0.0312 、0.0156、0 pg/μL。
N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer 稀释至2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0 pg/μL。
5-OMe-UTP 修饰dsRNA 标准品用STE buffer 稀释至4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 pg/μL

标准品稀释方法建议如下：

a）．无-修饰、 pUTP 修饰

操作步骤

（1）从室温（18-25℃）平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条加盖封板膜后用自封袋密封放回2~8℃。
（2）设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品100μL，样本孔中加入待测样本100μL。
 *当不能够确定待测样品中的dsRNA含量时，应当用STE buffer 做多个稀释倍数做检测，以免含量过高不能够读取有效数值。
（3）用封板膜封住反应孔，室温（18-25℃）下振板（500rpm）反应60min。
（4）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（250μL），静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。
（5）标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的生物i素化检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，室温（18-25℃）下振板（500rpm）反应60min。
（6）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（250μL），静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4 次。
（7）标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的HRP-链霉亲和素100μL，用封板膜封住反应孔，室温（18-25℃）下振板（500rpm）反应30min。
（8）弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（250μL），静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。
（9）每孔加入单组分底物显色液100μL，用封板膜封住反应孔，室温（18-25℃）静置避光反应30min。
（10）每孔加入终止液50μL，立即进行检测，设定酶标仪波长于450nm处( 建议用双波长450nm/650nm）。

结果处理

1.标准曲线

2.实验检测结果

注意事项

1.显色温度和时间对实验结果至关重要，应准确把握。
2.洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板30s后再甩干，以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3.所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4.若发现浓缩洗涤液中有结晶，可在37℃水浴锅中孵育，待结晶完-全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5.样本中应避免引入叠氮-化钠（NaN3），叠氮-化钠会破坏辣根过氧化酶活性，使检测值偏低。
6.实验操作过程中要严格避免RNase污染。
7.不可使用摇床代替振板机，若无振板机可采用室温（18-25℃）静置孵育，但静置孵育会造成检测灵敏度下降一倍左右。建议无-修饰、pUTP修饰标准品从2pg/μL开始稀释，N1-Me-pUTP 修饰标准品从4pg/ μL开始稀释，5-OMe-UTP修饰标准品从8pg/μL 开始稀释，HRP-SA孵育时长由30min 调整至60min。

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