Western Blot 实验,也叫蛋白质免疫印迹实验,主要用于检测和分析样品中的特定蛋白质。该技术涉及将蛋白质样品通过凝胶电泳分离,然后转移到膜上,通常使用硝酸纤维素或聚偏氟乙烯膜。转移后,膜上的蛋白质与特异性抗体结合,这些抗体可以识别目标蛋白。通过使用标记的二抗,可以检测出与目标蛋白结合的抗体。最后,通过化学发光、荧光或放射性标记等方法来可视化目标蛋白。Western Blot实验广泛应用于生物学和医学研究中,用于蛋白质表达分析、疾病标志物的检测以及信号传导途径的研究。具体实验细节,请一起阅读本篇文章,来了解一下Western Blot实验操作的全流程吧!
1. 蛋白提取:
① 准备工作:收集细胞或研磨组织(对于细胞,可先去除培养液,用预冷的 PBS 清洗;对于组织,可采用液氮研磨或匀浆器处理)。
② 裂解细胞 / 组织:加入适量的裂解液(通常已添加蛋白酶抑制剂,防止蛋白降解),比如每 106 个细胞中加入 100μl 裂解液。裂解液的体积需根据组织总量来决定,要确保蛋白提取物不会过于稀释,以减少蛋白质损失。将细胞或组织与裂解液充分混合,在低温(如 4℃)下持续振荡 15-30 分钟,期间为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。
③ 超声处理或抽打:冰上超声处理,一般使用 20-30% 功率,超声 1-2 分钟,目的是断裂 DNA,使蛋白更好地释放;也可以使用 1ml 注射器进行抽打,达到类似效果。
④ 离心:低温下以最高转速离心 20 分钟,上清液即为所需的蛋白样本,将其收集到新的离心管中备用。
2. 蛋白定量:
① 蛋白标准品稀释:用蛋白裂解液配制一系列浓度梯度的蛋白标准品。
② 加样:取 20μl 不同浓度蛋白标准品和 20μl 蛋白样品(如果样品显色过深,需要提前稀释)加到 96 孔板中,蛋白标准品和每个样品最好设置三个技术重复。
③ 配制 BCA 工作液并加样:根据待测孔数量,按 A 液:B 液 = 50:1 配制适量 BCA 工作液,充分混匀后加入 96 孔板中,每孔 200μl。
④ 孵育与检测:将 96 孔板在 37℃放置 20-30 分钟(也可以室温放置 2 小时,或 60℃放置 30 分钟),反应结束后,用酶标仪测定 96 孔板在 562nm 处的吸光值。
⑤ 计算蛋白浓度:根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。蛋白浓度测好后,加入 Loading Buffer 变性蛋白,准备上样跑胶。
3. 制胶:
① 组装制胶装置:将玻璃板卡在制胶架上,底部与海绵胶条贴紧,注意提前检查是否漏液。
② 配制分离胶:按照配方配制所需浓度的分离胶,注意 TEMED 要最后添加,充分混匀后,用移液枪小心地将分离胶溶液灌入组装好的玻璃板中,枪头要紧贴玻璃板内壁。
③ 液封分离胶:在分离胶表面轻缓地覆盖一层 ddH2O,使分离胶表面平整,室温静置凝固约 30-60 分钟(天气冷时凝胶时间需延长,建议提前配胶)。
④ 处理分离胶:待分离胶充分凝固后,小心倾斜或倒置弃去分离胶上层的 ddH2O,用洁净的滤纸伸入玻璃板吸走剩余的 ddH2O(注意滤纸不要触碰到分离胶)。
⑤ 配制浓缩胶:使用浓缩胶配方配制浓缩胶,同样 TEMED 最后添加,充分混匀。
⑥ 灌制浓缩胶:立即将浓缩胶溶液用移液枪小心地灌入分离胶上层,插入点样梳,确保凝胶中或梳齿周围没有气泡,让凝胶在室温下凝固约 30-60 分钟。
4. 电泳:
① 安装凝胶:将准备好的凝胶夹在电泳芯中,放置到电泳槽中,往槽中加入电泳液,如果同时跑两块胶,则液面达到下方刻度线,如果跑四块胶,则液面需要到达上方刻度线,内槽中电泳液需加满至溢出(若整个电泳槽未加满,开跑后需注意中间是否会漏液)。
② 上样:缓慢垂直向上拔出点样梳,上样前将上样孔中的气泡赶尽(若有),使用特定的凝胶上样枪头或 10μl 的枪头往上样孔中缓慢加入前期制备好的样品。
③ 设置电泳条件:盖上电泳槽,开启电源进行电泳(注意电极连接正确),浓缩胶的电压通常为 80V,分离胶的电压通常为 120V,电泳时间通常为 1 小时左右,但具体参数可根据目标蛋白的分子量进行相应调整。
④ 结束电泳:当染料分子溴酚蓝到达凝胶的底部时,关闭电源。此时蛋白会开始缓慢弥散,因此要迅速进行下一步操作。
5. 转膜:
① 配置转膜缓冲液:转膜缓冲液最好配成母液,现配现用。
② 活化 PVDF 膜:PVDF 膜使用前需在甲醇中活化。
③ 切胶与平衡:用 ddH2O 冲洗胶块后切除浓缩胶和溴酚蓝,在转膜缓冲液中平衡 3-5 分钟,留下含有目的蛋白的凝胶。
④ 构建 “转膜三明治":从负极到正极依次是海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵,注意 PVDF 膜贴合凝胶时,避免产生气泡。
⑤ 转膜:常见的转膜条件是 100V,1-2 小时(电压和时间可以根据蛋白分子量大小进行调整)。转膜结束后,可以用丽春红染色判断膜上是否有蛋白,这种方法可逆无毒,耗时短。
6. 封闭:
① 配置封闭液:转膜结束前 30min,以 TBST 为缓冲体系配置封闭液,并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀。
② 孵育:转膜结束后,在抗体孵育盒中加入适量封闭液,用镊子夹住膜,将其wan全浸泡在封闭液中,置于摇床上室温低速摇动孵育 1-2 小时,也可以 4℃冰箱孵育过夜。
7. 一抗 / 二抗孵育:
① 一抗孵育:根据抗体说明书稀释一抗,封闭液可作为抗体稀释液,也可使用 1×TBST 稀释一抗。将膜浸泡在稀释好的一抗中,保持适当的摇动使之均匀覆盖,常见的一抗孵育条件为室温 1.5-2 小时或 4℃过夜。
② 洗膜:一抗孵育结束后,用洗膜液(如 PBST 或 TBST,后者效果更好)洗去未结合的抗体,建议清洗 30 分钟,或 10 分钟 3 次 / 6 分钟 5 次。
③ 二抗孵育:参考一抗步骤稀释二抗,将膜浸泡在二抗中,室温孵育 45 分钟 - 1 小时。
8. 免疫检测:
① 洗膜:二抗孵育完毕后,回收二抗,用 TBST 洗膜,洗去未结合的二抗。
② 显影:将发光液敷在膜上,通过化学发光成像仪曝光,采集图像并使用 ImageJ 等软件分析灰度值。