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Lipofectamine™ 2000瞬时转染的实验流程

更新时间:2023-12-24点击次数:994

Lipo2000试剂的使用范围较广,它不仅可以用于质粒DNA转染、siRNA表达载体、双链核糖核酸dsRNA转染, 以及RNA等核酸转染,还可以用于文库筛选的高通量转染。对于细胞转染Lipo 2000几乎涵盖了HEK293、CHO细胞、HeLa等190多种细胞系。本期内容一起来学习下Lipofectamine™ 2000瞬时转染的实验流程吧!

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(一)细胞转染前的准备:


因转染效率依赖于细胞培养密度,而Lipo2000脂质体转染试剂具有细胞毒性,使用时需确保高细胞密度进行,建议根据细胞生长速度提前种板并使用不含抗生素的培养基培养,使转染时细胞呈对数生长并达到80%-90%汇合,有助于获得最高转染效率和表达水平,且能最小化高转染活性导致的细胞生长降低影响。(可通过预实验观察细胞对试剂毒性的耐受程度调整细胞密度。)

(二)DNA准备:

内毒素是影响转染效率高低的因素之一,请务必使用无内毒素的试剂盒抽提质粒,获得高纯度的DNA,紫外可见光光度法测浓度并标记计算用量。(质粒纯度:A260/A280 比值 (1.7-1.9),越近 1.8 越好)

(三)转染复合物制备:

血清会影响复合物的形成从而影响转染效率,用无血清培养基(比如Opti-MEM)稀释DNA和转染试剂。DNA和Lipo2000的比例,绝大多数细胞系通常推荐1:2-1:3,建议比例见下表。

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表:转染试剂Lipofectamine2000与质粒的用量参照表

对于每个转染样品(以六孔板为例),按如下方步骤制备转染复合物:


1) Lipo2000稀释液:取合适的EP管加入1500μl(250μl/孔) Opti-MEM,加入60μl(10μl/孔)Lipo2000混匀,室温下静置5分钟。

2) DNA稀释液:根据DNA的种类不同,分别于EP管中加入250μl/孔Opti-MEM,再加入4μg/孔质粒DNA轻轻混匀。

3) 将1)Lipo2000稀释液以250μl/孔加入到2)各DNA稀释液中,轻柔混匀,室温静置30min,形成DNA-Lipo2000复合物。

(四)转染操作:

细胞在转染前1小时左右更换新无双抗无血清培养基。将制备好的DNA-Lipo2000复合物分别加入细胞培养基中,将培养板轻轻摇动使复合物分布均匀。放入37℃ 5% CO2培养箱培养24-48h,并在4-6h后更换wan全培养基。

(五)观察:

如果转染的是带有荧光标签的质粒,可以在荧光显微镜下观察转染效率。

(六)注意事项:

1)Lipo2000脂质体转染试剂4℃保存,不可冻存。

2) Lipo2000脂质体转染试剂避免长时间暴露在空气中导致脂质体氧化而影响转染效率。

3)有些无血清培养基(比如DMEM,CD293,SFMII,V-SFM等)稀释DNA和转染试剂时转染效率有可能会降低。

4)Lipo2000脂质体转染试剂不能涡旋、离心、暴力吹打,缓慢晃动混匀即可。

5)用量仅供参考,具体用量请根据细胞类型、铺板密度等其他实验条件进行优化。

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