牛痘病毒加帽酶 ELISA 检测试剂盒说明书

货号：HG-VC001

产品简介：

帽子结构是真核生物中 mRNA 经转录后修饰在 5'端形成的一个特殊结构。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶。因此对使用了牛痘病毒加帽酶的生物制品，需要对其残留量进行检测。

本试剂盒采用双抗夹心酶联免疫检测(ELISA)法，将牛痘病毒加帽酶标准品和待测样本加入预包被抗牛痘病毒加帽酶抗体的酶标板，然后加入稀释后的生物i素标记的牛痘病毒加帽酶检测抗体，最后加入 Streptavidin-HRP，形成抗体+抗原+抗体。Biotin+ SA-HRP 复合物，洗板后加入 TMB 显色液显色。TMB 在 HRP 酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的牛痘病毒加帽酶的量呈正相关。

检测范围: 0.125~8 ng/mL

定量限:0.125ng/mL

规格：

96T

应用：

适用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

试剂盒组成：

备 注:所有组分存储温度均为 2~8℃，有效期12个月。

需自行准备的材料

◆酶标仪

◆去离子水

◆恒温培养箱

◆全新滤纸

◆微量移液器及吸头

◆涡旋振荡器

实验前准备

1.所有试剂以及待测样本需要恢复室温。所有试剂现配现用。

2.1x洗液配制:浓缩洗液平衡至室温(18~25°C)，不要有结晶。混匀后根据用量，取适量用超纯水按 1:19 的比例，将20x洗液稀释 20 倍，最终得到1x洗液。

3.1x 检测抗体配制:100x检测抗体充分溶解后，离心，取适量然后用稀释液2以1:99 的比例进行稀释。
4.1x酶结合物配制:500x酶结合物充分溶解后，离心，取适量然后用稀释液2以1:499 的比例进行稀释。
5.标准品的制备：

准备8个 1.5mL 离心管，按照标准品浓度依次标记。取一支冻干标准品加入 1mL 稀释液 1，彻i底溶解后静置 10 分钟，所得溶液浓度为 8ng/mL。各离心管分别加入 300uL 稀释液 1，再依次按下图进行梯度稀释:

操作步骤

使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温(18~25°C)。建议所有的标准品和待检样本进行双复孔测定。

1. 试剂准备:提前准备好各种待测试剂、稀释好的标准品和待测样本。

2.酶标板条确定:计算待测样本和标准品所需酶标板条，将酶标条从铝箔袋取出，剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存。

3.浸泡酶标板:加入 1xWash Buffer(300 μL/)浸泡酶标板，静置 30 秒后弃去孔中液体，拍干酶标板。洗板对试验结果有重要影响，确保最后一次拍板没有洗液残留。

4.样本孵育:加入标准品和待测样本，100 uL/孔，确保 15 min 内完成点样，37℃静置孵育1h。

5.洗板:弃去孔中液体，加入1xWash Buffer(300 μL/孔)洗板五次，拍干酶标板。

6.检测抗体孵育:将 1x 检测抗体加入酶标板中，100 μL/孔，37°C静置孵育1h。

7.洗板:弃去孔中液体，加入1xWash Buffer(300 μL/孔)洗板五次，拍干酶标板。

8.酶结合物孵育:将 1x 酶结合物加入酶标板中，100 μL/孔，37℃℃静置孵育 40 min。

9.洗板:弃去孔中液体，加入1xWash Buffer(300 μL/孔)洗板五次，拍干酶标板。

10.显色:使用前的10 min 将底物液恢复至室温(18~25°C)，将底物液 TMB加入酶标板中，100 uL/孔，37℃避光孵育 15min。

11.终止:加入 50 uL/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。

12.读值:20 min 内读取 450nm/630nm 波长处的吸光度值。450nm 作为检测波长，630nm 作为参比波长。

结果处理

1. 标准曲线OD处理（见下例，仅为示例，具体以实际测定为准）

2. 标准品理论浓度与对应 OD 值以四参数进行拟合，得到标准曲线(如下图所示)。

注意事项

1.样品首i次检测，建议进行至少3个连续倍数的稀释，以在标准曲线范围内产生至少一个稀释后样品。

2.试剂按标签说明储存，使用前室温(18~25℃℃)平衡。3.包被酶标板使用前，请平衡至室温(18~25°C)再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中密封，4℃可保存一个月。其余不用试剂应包装好或盖好。

4.实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

5.使用前检查试剂盒内各种试剂。试剂稀释、加样和终止反应应充分混匀或摇匀对实验结果尤为重要。

6.洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在洁净的纸中上充分拍干，直至看不到水印。勿将纸巾直接放入反应孔中吸水。

7.底物显色液对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免与金属接触影响结果。

8.本产品为一次性使用的试剂盒，请在效期内使用。

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