蛋白A（Protein A）ELISA 检测试剂盒说明书

货号：HG-PA001

产品简介：

BlueKit系列系列蛋白A（Protein A）ELISA检测试剂盒是用于定量检测生物制品中蛋白A残留量的专用试剂盒。

本试剂盒采用双抗夹心法，用捕获抗体包被96孔酶标板，制成固相抗体，随后加入标准品和检测样品，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的酶标抗体，形成一个固相抗体-蛋白A-酶标抗体的三明治结合物，反应结束后洗涤，然后加入底物进行显色反应，底物在HRP的催化下由无色转变成蓝色，并在终止液的作用下转变成最终的黄色。在450nm和630nm波长下测定其吸光度值（OD值），其中630nm为校正波长。OD值与样品中的蛋白A含量呈正相关。

检测范围： 5.12 - 500 pg/mL
定  量  限： 5.12 pg/mL
准  确  度： 80% - 120%

规格：

96T

应用：

适用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

试剂盒组成：

备 注:所有组分存储温度均为 2~8℃，有效期12个月。

需自行准备的材料

◆酶标仪

◆去离子水

◆微孔板恒温振荡器

◆全新滤纸

◆微量移液器及吸头

◆涡旋振荡器

实验前准备

1.1x样品稀释液配制: 取样品稀释液（20×）加去离子水稀释20倍备用，如：取样品稀释液（20×）10mL加去离子水190mL混匀。

2.1x 洗液配制：取洗液（20×）加去离子水稀释20倍备用，如：取洗液（20×）10mL 加去离子水190mL混匀。
（注意：样品稀释液（20×）、洗液（20×）中如果有结晶形成，应置于室温或37℃水浴轻轻摇晃，待结晶完-全溶解后再进行稀释）

3.显色液配制：将显色液A、显色液B等体积混合，混匀后避光放置。（注：不能放置太久，一般使用前的10min配制。如混合后显色液已经变蓝，请勿使用）。
4.标准品的制备（注：每次实验需使用新配制的标准品溶液）
试剂盒中放置不同类型的Protein A标准品，请根据所使用的Protein A亲和树脂类型选择对应的标准品建立标准曲线。若无法获得对应的Protein A配基，对于重组型树脂，可使用本试剂盒中的重组Protein A（楚天微球）建立标准曲线；对于耐碱型树脂，可使用本试剂盒中适用于MabSelect SuRe配基的标准品建立标准曲线。
稀释过程：用样品稀释液（1×）将标准品（50ng/mL）稀释至500pg/mL，然后系列倍比（稀释倍数：2.5 倍）稀释配制标准品，如下图。

5. 待测样品稀释：将样品恢复至室温，混匀；使用样品稀释液（1×）将样品进行稀释。针对不同样品，需要进行样品浓度稀释倍数的验证。推荐样品稀释浓度范围为0.01-1mg/mL。
6. 加标样品制备：选择合适浓度的待测样品，分为体积相同的3-4份，在其中2-3份样品中加入不同浓度相同体积的待测物标准品，制备待回收分析样品。待测物标准品加入体积小于等于总体积的10%，制成2-3 个不同浓度的待回收分析样品，计算加入的待测物标准品的浓度。

操作步骤

所有操作在室温（18-25℃）下进行，建议所有加样孔进行复孔测定。
1.将试剂盒各组分恢复室温30min，从已平衡至室温的铝箔袋中取出试验所需板条，用记号笔标记板条顺序，剩余板条用封板膜封板后重新放回铝箔袋中，封好，置于2-8℃保存。（注：在洗板过程中板条容易脱落，注意做好标记。）
2.样品温育：将制备好的标准品和样品加入酶标板中（加入顺序建议：标准品孔、空白孔、样品孔、加标样品孔，标准品按照浓度梯度加入），100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振荡温育1h。（注：加样时间控制在 10min 以内，避免随时间出现的漂移。温育过程中如果不封板或者封板不完-全，会导致反应液蒸发，导致实验误差。）
3.洗板：温育完成后，小心揭去封板膜，弃去孔中液体，用样品稀释液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的残留液体。（如果洗板方式为手洗，加样品稀释液（1×）后可静置1min；如果采用洗板机洗板，加样品稀释液（1×）后可轻微震荡5s）
4.酶标抗体温育：加入酶标抗体，100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振荡温育1h。
5.洗板：温育完成后，小心揭去封板膜，弃去孔中液体，用洗液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的残留液体。
6.显色：将预先配置好的显色液加入酶标板中，100µL/孔，用封板膜封板，37℃避光静置温育15min。
7.终止：加入终止液，100µL/孔，显色均匀后即可读数。（注：一般加入终止液后10min内完成）
8.读数：将酶标板放入酶标仪中，设置波长为双波长450/630nm，读取吸光度值。（注：建议在酶标仪读数程序中设置5-10s的震荡）。

结果处理

以下标准曲线图仅供参考，应以同次实验标准品所绘标准曲线为准。
1.适用于MabSelect SuRe配基标准品的标准曲线

2. 适用于MabSelect PrismA配基标准品的标准曲线

3.重组Protein A（楚天微球）的标准曲线

4.MaXtar^® ARPA ligand Protein A（百林科 Bio-Link）的标准曲线

注意事项

1.样品首i次检测，建议进行至少3个连续倍数的稀释，以在标准曲线范围内产生至少一个稀释后样品。

2.试剂按标签说明储存，使用前室温(18~25℃℃)平衡。3.包被酶标板使用前，请平衡至室温(18~25°C)再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中密封，4℃可保存一个月。其余不用试剂应包装好或盖好。

4.实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

5.使用前检查试剂盒内各种试剂。试剂稀释、加样和终止反应应充分混匀或摇匀对实验结果尤为重要。

6.洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在洁净的纸中上充分拍干，直至看不到水印。勿将纸巾直接放入反应孔中吸水。

7.底物显色液对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免与金属接触影响结果。

8.本产品为一次性使用的试剂盒，请在效期内使用。

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