慢病毒滴度 p24快速ELISA检测试剂盒说明书

货号：HG- P001L

产品简介：

在慢病毒载体制备的工艺开发过程中,需关注病毒载体质量标准的建立,包括病毒滴度、宿主细胞 DNA残留、宿主细胞蛋白残留。支原体等检测指标。测量病毒滴度对于病毒使用以及进行感染细胞是至关重要的，也是慢病毒载体生产的关键质量属性(CQA)。滴度检测包括物理滴度(病毒载体总颗粒数)和转导滴度(病毒载体感染性颗粒数)。物理滴度:载体特定蛋白/核酸的定量可用于载体颗粒数量(物理滴度)的估计。也即总颗粒数和基因组滴度表示病毒的物理数量,为物理滴度。例如，HIV-1衍生的慢病毒载体,可通过 ELISA方法检测病毒载体样本中的 p24 蛋白从而进行物理滴度的检测，也可以通过 qPCR 的方法检测载体基因组 RNA拷贝数而实现物理滴度的检测。
本试剂盒采用双抗体夹心法(一种 ELISA 法)检测供试品中的 p24总含量，通过换算，得到 p24 的物理滴度。使用预先包被有抗 HIV-1 p24 捕获抗体的微孔板，反应孔内加入标准品及待测样本，同时加入抗 HIV-1 p24二抗，室温孵育，形成抗体-抗原二抗复合物。洗涤除去未结合物，通过 HRP 催化底物 TMB 产生蓝色，终止后使用酶标仪在 450 nm~630 nm 波长下检测吸光度,根据标准曲线计算供试品中 p24 含量。
检测范围:1.37 ng/mL~1000 ng/mL

规格：

96 T

应用：

适用于快速检测基于HIV-1的慢病毒的p24蛋白含量测定。

产品组成：

产品储存条件与有限期：

所有试剂在2 ~ 8℃条件下有效期为12个月，开封后，未使用完的试剂盒，仍在规定储存条件下保存。

需要准备的试剂、耗材与设备：

实验前请准备好下列试剂、耗材与设备：

◆ 生物安全柜
◆ 酶标仪（至少配备450nm和630nm波长）
◆ 各规格移液器（如1000 μL，200 μL，10 μL等）
◆ 涡旋仪
◆ 吸水纸
◆ 恒温振荡孵育器
◆ 1000 μL，200 μL，10μL 等低吸附枪头
◆ 离心机
◆ 去离子水

实验步骤：

1.检测流程图

总时长约1小时

2. 准备工作

1. 打开生物安全柜紫外灯，照射30分钟。
2. 试剂盒提前从2-8℃冰箱取出后，于室温放置至平衡（30分钟及以上），保证本次实验检测所需试剂。试剂盒开启时要标注开启日期，优先使用先开启的试剂盒，同一批号试剂盒可以混用，不同批号试剂盒不可混用。准备本次实验所需要的Coated Plate，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求于2 ~ 8℃保存，以备下次使用。
3. 洗涤液配制：用去离子水将10×PBST Wash Buffer 稀释至1×Wash Buffer，混匀，即得。
4. 供试品溶液配制：供试品的稀释需在生物安全柜内操作，使用Sample Diluent Buffer进行稀释。供试品稀释或加样前，确认供试品已溶解并平衡室温，操作前使用90%体积量程的移液器连续匀速吹打混匀20次或低速振荡混匀，待供试品样本充分混匀后使用。稀释倍数可根据实际浓度进行适当调整。注意：单步稀释倍数不应高于10倍。
5. 标准品浓度确认：

6.  内控溶液配制（200 ng/mL标准品）：取80 μL Sample Diluent Buffer，加入1000 ng/mL 标准品（S1）20 μL，混匀即得。
7.  加标质控溶液配制：取供试品溶液20 μL，加入20 μL 的200 ng/mL标准品，混匀，即得。
8.  阴性对照样本：取Sample Diluent Buffer直接检测。
9. 加样板布局（仅供参考，可根据实验实际需要进行调整）：

10.加样：取出已平衡至室温的Coated Plate，依次加入Virus Lysis，50 μL/孔；再分别加入HIV-1 p24 Standard 0 ng/mL、1.37 ng/mL、4.12 ng/mL、12.35 ng/mL、37.04 ng/mL、111.11 ng/mL、333.33 ng/mL、1000 ng/mL、供试品溶液、阴
性对照、加标质控溶液、内控溶液，各10 μL/孔，平行2孔。
11.加酶标二抗：每孔加50 μL Anti HIV-1 p24+HRP。
12.孵育：用封板膜封板后，放置恒温震荡孵育器中，调节参数，室温18 ~ 25℃，500转/分钟，孵育30分钟。
13.洗涤：在生物安全柜内，小心揭掉封板膜，将板孔内液体倾倒于废液缸中，在事先准备好的吸水纸上将板孔内液体拍干，每孔加入300 μL 1× Wash Buffer，静置30秒后，将板孔内液体倾倒于废液缸中，在吸水纸上拍干（确保孔内无残留液体），如此重复4次。
14. 显色：加入Color Reagent，各100 μL/ 孔。此步骤需要在生物安全柜中避光操作（关闭照明）。
15. 孵育：用封口膜封板后置恒温震荡孵育器中，调节参数，室温18 ~ 25℃避光孵育5 ~ 10分钟。
16. 终止：孵育结束后，加Stop Solution各100 μL/孔，在25分钟内，用酶标仪于450nm检测波长、630nm 参比波长下读取吸光度。

结果分析：

1. 以标准品的吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，采用四参数拟合方式对标准曲线进行拟合。

2. 示意图：

3. 结果计算

1). 供试品最终p24含量（ng/mL）计算公式
   供试品最终p24含量（ng/mL）=稀释倍数×四参数拟合供试品p24含量
2). 病毒颗粒数（PP/mL）计算公式
 病毒颗粒数（PP/mL）=供试品最终Lenti-p24含量×1.25×10⁷
3). 内控溶液回收率计算

回收率%  = 内控检测浓度/内控理论浓度 × 100%

4). 加标回收率的计算

回收率% =（加标检测浓度×总体积）-（供试品检测浓度×供试品体积）/加标理论浓度 × 加标体积 × 100%

4. 系统适用性

1. 对于检测值≥1.37 ng/mL的检测复孔（包括标准品，加标质控样品和检测样品），复孔OD CV值需≤20%；
2. 标准曲线决定系数R² > 0.980；
3. 内控溶液回收率为70% ~ 130%
4. 加标质控样本的回收率在70% ~ 130%之间；