E.coli残留总RNA检测试剂盒用于定量检测各种生物制品中大肠杆菌总RNA的残留情况,辅助进行生物制品的核酸质控。本试剂盒使用RT-PCR荧光探针法原理,将反转录和荧光探针qPCR检测技术融合,可实现一步法定量检测。通过在大肠杆菌含量高、表达稳定的RNA靶标上,设计特异性引物和探针,通过绝对定量的方法测定总RNA残留。
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E.coli 残留总RNA检测试剂盒
货号:HG-ER001
E.coli 残留总RNA试剂盒用于定量检测各种生物制品中大肠杆菌总RNA的残留情况,辅助进行生物制品的核酸质控。本试剂盒使用RT-PCR荧光探针法原理,将反转录和荧光探针qPCR检测技术融合,可实现一步法定量检测。通过在大肠杆菌含量高、表达稳定的RNA靶标上,设计特异性引物和探针,通过绝对定量的方法测定总RNA残留。
100 Reactions
组分 | 管数 | 体积 | 存储条件 |
---|---|---|---|
One Step RT-qPCR buffer | 1 | 1mL | -20℃ |
One Step Enzyme Mix | 1 | 100μL | -20℃ |
E.coli RNA Primer& Probe Mix | 1 | 370μL | -20℃ |
E.coli RNA定量标准品(2ng/μL) | 1 | 25μL | -20℃ |
RNA IPC Primer&Probe Mix | 1 | 370μL | -20℃ |
ROX High | 1 | 50μL | -20℃ |
ROX Low | 1 | 50μL | -20℃ |
RNA稀释液 | 2 | 1mL | -20℃ |
所有试剂都于-20℃避光保存与运输,有效期18个月
1.样品中大肠杆菌(E.coli)RNA残留检测作为残留类的检测项目,检测前需要去除供试品中的DNA,因此需要对供试品进行样本前处理。可选择使用我司配套的样本前处理试剂盒,处理方式如下 :
组分名称 | 单反应用量(μL) |
---|---|
DNase I | 1 |
10X Reaction Buffer with MgCl2 | 2 |
RNase Inhibitor | 0.5 |
无酶去离子水 | 12.5 |
供试品 | 4 |
2. 按照上表方式配置供试品 DNaseI 消化液,震荡混匀,离心 5s;
3. 将配置完成的供试品 DNaseI 消化液置于 37℃恒温水浴锅中孵育 60min;
4. 取出孵育后供试品 DNaseI 消化液,瞬时离心 5s 后置于 65℃干式恒温器中孵育 10min 灭活 DNase I 酶,将灭活后的供试品DNaseI 消化液放置于 2-8℃冰箱暂存。
1.定量参考品及NTC制备
1.1 将试剂盒中的大肠杆菌RNA定量标准品和RNA稀释液置于冰上,待完i全融化后,轻微振荡混匀,短暂离心将液体甩至管底;
1.2 取6支干净的1.5mL离心管,分别标记为ST0,ST1,ST2,ST3,ST4,ST5;
1.3按下表进行标准品的梯度稀释,每次稀释确保充分混匀后再进行下一个梯度的稀释。(表格中的体积仅供参考,可根据实际实验需求等比例扩大);
稀释管 | 稀释体积 | 浓度(fg/μL) |
ST0 | 5 μL定量参考品+ 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+05 |
ST1 | 5 μL ST0 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+04 |
ST2 | 5 μL ST1 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+03 |
ST3 | 5 μL ST2 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+02 |
ST4 | 5 μL ST3 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+01 |
ST5 | 5 μL ST4 + 45 μL RNA稀释液 | 2.00E+00 |
1.4 NTC 的制备:100uL RNA 稀释液。
2.RT-qPCR反应液的制备和加样
2.1 从冰箱里取出各试剂置于冰上解冻;
2.2 PCR反应液配制:详见表5,One Step RT-qPCR buffer、One Step Enzyme Mix、E.coli RNA Primer& Probe Mix、ROX,这4种试剂可提前预混成Mix, 再依次加入5μL标曲 (ST1/ST2/ST3/ST4/ST5)、NTC、供试品溶液,混匀。每个样各做三个平行。
2.3 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:
Mix混合液 =(反应孔数+2)× (10+1+3.6+0.4) μL(含有2孔的损失量)
加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完i全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
组分 | 单孔反应(μL) | 备注 |
One Step RT-qPCR buffer | 10 | 可以提前预混Mix,每孔加 15μL mix再对应加5μL标曲/ NTC/样品 |
One Step Enzyme Mix | 1 | |
E.coli RNA Primer&Probe Mix | 3.6 | |
ROX | 0.4 | |
标曲/NTC/样品 | 5 | |
总体积 | 20 |
RT-qPCR反应液配制表
*请对应机型选择适配的ROX;若机型适配为no ROX,请加入等体积的去离子水(要求无核酸及核酸酶污染级去离子水)。
3. IPC组配制反应液的制备和加样(如果在检测中已经有如加标回收等方式,IPC检测可以取消)每次实验需做一个无模板对照(IPC-NTC)和各个待测样本的IPC(IPC-S)检测,根据下表:
组分 | 单孔反应(μL) | 备注 |
One Step RT-qPCR buffer | 10 | 可以提前预混Mix,每孔加 15μL mix 再对应加5μL IPC-样 品 / IPC-NTC |
One Step Enzyme Mix | 1 | |
RNA IPC Primer&Probe Mix | 3.6 | |
ROX | 0.4 | |
IPC-NTC / IPC-样品 | 5 | |
总体积 | 20 |
IPC RT-qPCR反应液配制表
备注:
加标体系ERC:90μL 样品+10μL ST3;
加标回收率=ERC/(0.9*样品+0.1*ST3);(加标回收率质控标准:50%~150%)
加标回收与IPC二选一,如选择加标回收,可将表7中IPC-S更换为ERC-S。
4.反应孔排版示例
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
F | IPC-S1 | IPC-S1 | IPC-S1 | |||||||||
G | NTC | NTC | NTC | IPC-S2 | IPC-S2 | IPC-S2 | ||||||
H | IPC-NTC | IPC-NTC | IPC-NTC | IPC-S3 | IPC-S3 | IPC-S3 |
备注:该示例表示的是检测5个浓度梯度的RNA标准曲线、1个无模板对照NTC、3个待测样本。针对IPC的无模板对照(IPC-NTC)和待测样本的 IPC(IPC-S1,IPC-S2,IPC-S3)。每个检测做3个重复孔。实际检测时可根据样本多少,参照上表示例进行96孔板排版加样。
加样完成后将96孔板用光学膜封闭,轻微震荡混匀,用96孔板专用离心机短暂离心将液体全部甩至管底后放入qPCR仪中。
(以ABI公司7500 qPCR仪,软件版本V2.0.6为例)
1.创建空白新程序,选择绝对定量检测模板,taqman探针法。
2.创建新检测探针,命名为E.coli RNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none;创建新检测探针,命名为RNA IPC,选择报告荧光基团为VIC,猝灭荧光基团为none;检测参比荧光为 ROX。
3.设置三步法反应程序如下表:反应体积 20μL。
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
逆转录 | 50℃ | 15min | 1 |
预变性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
变性 | 95℃ | 10sec | 45 |
退火/延伸(收集荧光) | 60℃ | 40 sec |
反应程序
4. 运行PCR程序。
1. 在Results 的Amplification Plot 中,可初步查看扩增曲线的形态是否正常。机器通常会自动设置阈值(Threshold )和基线(Baseline),当target设置等不同时可能会出现多个阈值,而导致结果分析有误,此时请手动设置阈值线,但需确保设置的阈值线在指数扩增区,如通常Threshold设置为0.15,选Auto Baseline,点击Analyze,可看到调整后的结果。
2. 在Results的Standard Curve 中,可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R2。 可接受标准Effective:85%~110%,R2≥0.98;
3. 在Results 的Report中,Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、待测样本的检测值,单位为fg/μL。NTC的Ct值应大于ST5的Ct值,检测值应低2fg/μL。
4. 分析IPC的Ct值,正常情况下样本的Ct-IPC值应该与无模板对照NTC的Ct-IPC值一致或±2。如样本的Ct-IPC值与无模板对照NTC的Ct-IPC值相比明显增大,则表明样本可能存在明显抑制。
5. E.coli RNA 残留量计算:
异常数据及检测过程出现意外情况比如管漏液,样本蒸发以及样本加错等,其产生的数据应删除,并在检测记录中说明原因,其他正常的数据可以继续应用于检测结果的计算中
1. 本试剂盒已通过稳定性(冻融等因素)的验证,无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品(参考品和待测样品等)的配制环境需区分区域,不可在一个区域内操作,配制人员需穿戴整齐,戴
好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头,避免交叉污染,避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法,全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证优良检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测,以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责,不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责,请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量,
预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断。
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