293T 细胞残留DNA片段分析检测试剂盒 (qPCR-荧光探针法)说明书

货号：HG-HF003

产品简介：

本试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品及成品中293T细胞DNA残留片段大小分布的专用试剂盒。
本试剂盒利用PCR荧光探针法原理，定量检测样本中293T细胞DNA残留片段大小分布，本试剂盒设计三种不同的扩增片段（99bp、200bp、307bp），用293T细胞DNA定量参考品分别对不同的扩增片段制作标曲，通过不同大小片段的比值分析样本中293T细胞残留DNA的片段分布情况。

规格：

3 × 100 Reactions

产品组成：

产品储存条件与有限期：

-20℃储存，有效期 18 个月。

适用机型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同机型使用时，请注意选择适配的参比染料 ROX

需要准备材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 无菌低吸附离心管
◆ 离心机
◆ 荧光定量 PCR 仪
◆ 与 PCR 仪适配的 96 孔 qPCR 板或八联排管
◆ 震荡器
◆ 1000μL，200μL，10μL 无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 各规格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）

操作步骤：

一、293T DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 293T DNA 定量参考品（浓度为 3ng/μL）进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 × 10⁵fg/μL、3 × 10⁴fg/μL、3 ×10³fg/μL、 3 ×10²fg/μL，3 × 10¹ fg/μL。具体操作如下：
1. 将试剂盒中 293T DNA定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上，待完i全融化后，轻微振荡混匀，短暂离心将液体甩至管底。
2. 取 5 支干净的 1.5mL 离心管，分别标记为 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180μL DNA 稀释液。
4. 按表 2 依次进行 5 次稀释操作，每次稀释后确保充分混匀后再进行下一个梯度的稀释。如先取 20μL 293T DNA定量参考品加入步骤 3 准备好的 ST1 管中，轻微振荡充分混匀，短暂离心将液体甩至管底；然后再取 20μL ST1 中的标准品加入步骤 3准备好的 ST2 管中……依次稀释。

表 2. 标准品稀释过程

二、阴性质控 NCS 及 NTC 的准备

取 100μL DNA 稀释液加入 1.5mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 可和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
qPCR 反应加样时，加入 10μL DNA 稀释液即为阴性对照 NTC。
注：为了满足同步进行三个不同扩增长度的片段分析检测需求，样本前处理中 DNA 洗脱体积需要≥ 100μL。

三、加标体系制备

加标回收 ERC：建议 90uL 样品 +10uLST3，也可根据实际情况按照其他方式制备。
加标回收率计算：ERC 回收率在 50%~150% 之间（加标回收率 =ERC/(0.9* 样品 +0.1*ST3）

四、qPCR 反应液的制备

1. 从冰箱里取出各试剂置于冰上。
2. 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔 / 样。即反应孔数 =（5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS + 待测样本数量）×3。
3. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR 反应液总量： qPCR 反应液 =（反应孔数 +2）× 20μL（含有 2 孔的损失量）。
4. 待各试剂放在冰上充分融化后，参考表 3、4、5 所示并组合反应孔数准备对应扩增片段的 qPCR 反应液，并充分混匀。

表 3. 99bp qPCR 反应液配制表

表 4. 200bp qPCR 反应液配制表

表 5. 307bp qPCR 反应液配制表

* 请对应机型选择适配的 ROX；若机型适配为 no ROX，请加入等体积的去离子水（要求无核酸及核酸酶污染级去离子水）。

五、上样

1. 将配制的各 qPCR 反应液轻微振荡混匀，短暂离心将液体甩至管底。按 20μL/ 孔加入排版设计（如表 9 示例或按个人设计调整）对应的孔中，选择对应扩增片段参考表 6、7、8 所示加样，加样后每孔总体积 30μL。

表 6. 99bp 各反应孔加样示例

表 7. 200bp 各反应孔加样示例

表 8. 307bp 各反应孔加样示例

表 9 96 孔板排版示例

& 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对 NTC、1 个阴性质控 NCS、3 个待测样本。每个检测做 3 个重复孔。也可根据自己的使用习惯进行设计排版。

2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，用 96 孔板专用离心机短暂离心装液体全部甩至管底后放入 qPCR 仪中。

六、上机

以 ABI 公司 7500 qPCR 仪，软件版本 V2.0.6 为例。
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板，taqman 探针法。
2. 三组 qPCR 反应液创建新检测探针，分别命名为 99bp、200bp、307bp，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX。
3. 将板上标准品对应的孔选择为 Standard，分别赋值为 3 x 10⁵、3 x 10⁴、3 x 10³、 3 x 10²，3 x 10¹ （单位为 fg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5；NTC 选择 Negative Control，NCS 和待测样品孔选择为 Unknow，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S1、S2、S3。
4. 设置三步法反应程序：95℃ 5min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1 min，45 个循环；反应体积 30μL。
5. 运行 PCR 程序。

七、qPCR 结果分析

1. 在 Results 的 Amplification Plot 中，可初步查看扩增曲线的形态是否正常。机器通常会自动设置阈值（Threshold）和基线（Baseline），当 target 设置等不同时可能会出现多个阈值，而导致结果分析有误，此时请手动设置阈值线，但需确保设置的阈值线在指数扩增区，如通常 Threshold 设置为 0.15，选择 Auto Baseline，点击 Analyze，可看到调整后的结果。
2. 数据可靠性分析：
• 三个平行孔间 Ct 值差应小于 1.0，Ct 值大于 35 的孔除外；
• 阴性对照 NTC 和 NCS 的 CT 值都应大于标曲最i低浓度的 CT 值或根据实验室自身验证结果设定标准；
• 标准曲线相关系数 R2 ≥ 0.98，扩增效率 85%~110% 之间；
• ERC 回收率在 50%~150% 之间；
3. 以 99bp 片段的待测样本检测值为 100%，计算 200bp 片段、307bp 片段的待测样本百分比。