293T细胞残留DNA片段分析检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品及成品中293T细胞DNA残留片段大小分布的专用试剂盒。
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货号:HG-HF003
本试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品及成品中293T细胞DNA残留片段大小分布的专用试剂盒。
本试剂盒利用PCR荧光探针法原理,定量检测样本中293T细胞DNA残留片段大小分布,本试剂盒设计三种不同的扩增片段(99bp、200bp、307bp),用293T细胞DNA定量参考品分别对不同的扩增片段制作标曲,通过不同大小片段的比值分析样本中293T细胞残留DNA的片段分布情况。
3 × 100 Reactions
序号 | 组分 | 装量/管 | 数量 | 存储条件 |
1 | 293T Primer&Probe MIX-99 | 300μL | 1 | -20℃,避光保存 |
2 | 293T Primer&Probe MIX-200 | 300μL | 1 | -20℃,避光保存 |
3 | 293T Primer&Probe MIX-307 | 300μL | 1 | -20℃,避光保存 |
4 | 293T DNA 定量参考品 | 60μL | 1 | -20℃ |
5 | 2×Probe qPCR Mix | 1.25mL | 4 | -20℃ |
6 | DNA稀释液 | 1mL | 4 | -20℃ |
7 | IPC Mix | 450μL | 1 | -20℃,避光保存 |
8 | ROX High* | 200μL | 1 | -20℃,避光保存 |
9 | ROX Low* | 200μL | 1 | -20℃,避光保存 |
-20℃储存,有效期 18 个月。
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A(博日)
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同机型使用时,请注意选择适配的参比染料 ROX
仪器 | ROX参比染料 |
Applied Biosystems®5700,7000,7300,7700,7900HT,StepOneTM,and StepOnePlusTM | ROX High |
Applied Biosystems®7500,ViiATM 7,QuantStudioTM12K Flex,Agilent Mx3000PTM,Mx3005PTM,and Mx4000TM | ROX Low |
Rotor-GeneTM,DNA Engine OpticonTM,OpticonTM2,Chromo 4TMReal-Time Detector,Mastercycler®ep realplex, Smart Cycler®,Roche LightCycle®480,Roche LightCycler®Nano,Bio-Rad CFX96,and llumina EcoTM | No ROX |
◆ 1.5mL 或 2mL 无菌低吸附离心管
◆ 离心机
◆ 荧光定量 PCR 仪
◆ 与 PCR 仪适配的 96 孔 qPCR 板或八联排管
◆ 震荡器
◆ 1000μL,200μL,10μL 无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 各规格移液器(如 1000μL,200μL,10μL,2.5μL 等)
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 293T DNA 定量参考品(浓度为 3ng/μL)进行梯度稀释,稀释浓度依次为 3 × 105fg/μL、3 × 104fg/μL、3 ×103fg/μL、 3 ×102fg/μL,3 × 101 fg/μL。具体操作如下:
1. 将试剂盒中 293T DNA定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上,待完i全融化后,轻微振荡混匀,短暂离心将液体甩至管底。
2. 取 5 支干净的 1.5mL 离心管,分别标记为 ST1,ST2,ST3,ST4,ST5。
3. 在 ST1,ST2,ST3,ST4,ST5 管中分别加入 180μL DNA 稀释液。
4. 按表 2 依次进行 5 次稀释操作,每次稀释后确保充分混匀后再进行下一个梯度的稀释。如先取 20μL 293T DNA定量参考品加入步骤 3 准备好的 ST1 管中,轻微振荡充分混匀,短暂离心将液体甩至管底;然后再取 20μL ST1 中的标准品加入步骤 3准备好的 ST2 管中……依次稀释。
表 2. 标准品稀释过程
标准品代号 | 稀释体积 | 浓度 |
ST1 | 180μL DNA 稀释液 +20μL 293T DNA定量参考品 | 3 × 105 fg/μL |
ST2 | 180μL DNA 稀释液 +20μL ST1 | 3 × 104 fg/μL |
ST3 | 180μL DNA 稀释液 +20μL ST2 | 3 × 103 fg/μL |
ST4 | 180μL DNA 稀释液 +20μL ST3 | 3 × 102 fg/μL |
ST5 | 180μL DNA 稀释液 +20μL ST4 | 3 × 101 fg/μL |
取 100μL DNA 稀释液加入 1.5mL 干净的离心管中,标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 可和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控 NCS 纯化液。
qPCR 反应加样时,加入 10μL DNA 稀释液即为阴性对照 NTC。
注:为了满足同步进行三个不同扩增长度的片段分析检测需求,样本前处理中 DNA 洗脱体积需要≥ 100μL。
加标回收 ERC:建议 90uL 样品 +10uLST3,也可根据实际情况按照其他方式制备。
加标回收率计算:ERC 回收率在 50%~150% 之间(加标回收率 =ERC/(0.9* 样品 +0.1*ST3)
1. 从冰箱里取出各试剂置于冰上。
2. 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量,计算所需反应孔数,一般做 3 个重复孔 / 样。即反应孔数 =(5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS + 待测样本数量)×3。
3. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR 反应液总量: qPCR 反应液 =(反应孔数 +2)× 20μL(含有 2 孔的损失量)。
4. 待各试剂放在冰上充分融化后,参考表 3、4、5 所示并组合反应孔数准备对应扩增片段的 qPCR 反应液,并充分混匀。
表 3. 99bp qPCR 反应液配制表
组分 | 单孔反应 |
2×Probe qPCR Mix | 15μL |
293T Primer&Probe MIX-99 | 3μL |
IPC Mix | 1.4μL |
ROX* | 0.6μL |
总体积 | 20μL |
表 4. 200bp qPCR 反应液配制表
组分 | 单孔反应 |
2×Probe qPCR Mix | 15μL |
293TPrimer&Probe MIX-200 | 3μL |
IPC Mix | 1.4μL |
ROX* | 0.6μL |
总体积 | 20μL |
表 5. 307bp qPCR 反应液配制表
组分 | 单孔反应 |
2×Probe qPCR Mix | 15μL |
293T Primer&Probe MIX-307 | 3μL |
IPC Mix | 1.4μL |
ROX* | 0.6μL |
总体积 | 20μL |
* 请对应机型选择适配的 ROX;若机型适配为 no ROX,请加入等体积的去离子水(要求无核酸及核酸酶污染级去离子水)。
1. 将配制的各 qPCR 反应液轻微振荡混匀,短暂离心将液体甩至管底。按 20μL/ 孔加入排版设计(如表 9 示例或按个人设计调整)对应的孔中,选择对应扩增片段参考表 6、7、8 所示加样,加样后每孔总体积 30μL。
表 6. 99bp 各反应孔加样示例
ST-99bp | 20μL99bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5 |
NTC | 20μL99bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液 |
NCS | 20μL99bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液 |
待测样本 | 20μL99bp qPCR反应液+10μL待测样本 |
表 7. 200bp 各反应孔加样示例
ST-200bp | 20μL200bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5 | ||||||||||||
NTC | 20μL200bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液 | ||||||||||||
NCS | 20μL200bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液 | ||||||||||||
待测样本 | 20μL200bp qPCR反应液+10μL待测样本 |
表 8. 307bp 各反应孔加样示例
ST-307bp | 20μL307bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5 |
NTC | 20μL307bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液 |
NCS | 20μL307bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液 |
待测样本 | 20μL307bp qPCR反应液+10μL待测样本 |
表 9 96 孔板排版示例
99bp | 200bp | 307bp | ||||||||||
ST1 | ST1 | ST1 | S2 | ST1 | ST1 | ST1 | S2 | ST1 | ST1 | ST1 | S2 | A |
ST2 | ST2 | ST2 | S2 | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | B |
ST3 | ST3 | ST3 | S2 | ST3 | ST3 | ST3 | S2 | ST3 | ST3 | ST3 | S2 | C |
ST4 | ST4 | ST4 | S3 | ST4 | ST4 | ST4 | S3 | ST4 | ST4 | ST4 | S3 | D |
ST5 | ST5 | ST5 | S3 | ST5 | ST5 | ST5 | S3 | ST5 | ST5 | ST5 | S3 | E |
S1 | S1 | S1 | S3 | S1 | S1 | S1 | S3 | S1 | S1 | S1 | S3 | F |
NTC | NTC | NTC | NTC | NTC | NTC | NTC | NTC | NTC | G | |||
NCS | NCS | NCS | NCS | NCS | NCS | NCS | NCS | NCS | H | |||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
& 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对 NTC、1 个阴性质控 NCS、3 个待测样本。每个检测做 3 个重复孔。也可根据自己的使用习惯进行设计排版。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭,轻微震荡混匀,用 96 孔板专用离心机短暂离心装液体全部甩至管底后放入 qPCR 仪中。
以 ABI 公司 7500 qPCR 仪,软件版本 V2.0.6 为例。
1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板,taqman 探针法。
2. 三组 qPCR 反应液创建新检测探针,分别命名为 99bp、200bp、307bp,选择报告荧光基团为 FAM,猝灭荧光基团为 none;创建新检测探针,命名为 IPC,选择报告荧光基团为 VIC,猝灭荧光基团为 none,检测参比荧光为 ROX。
3. 将板上标准品对应的孔选择为 Standard,分别赋值为 3 x 105、3 x 104、3 x 103、 3 x 102,3 x 101 (单位为 fg/μL),并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5;NTC 选择 Negative Control,NCS 和待测样品孔选择为 Unknow,并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S1、S2、S3。
4. 设置三步法反应程序:95℃ 5min;95℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 1 min,45 个循环;反应体积 30μL。
5. 运行 PCR 程序。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 中,可初步查看扩增曲线的形态是否正常。机器通常会自动设置阈值(Threshold)和基线(Baseline),当 target 设置等不同时可能会出现多个阈值,而导致结果分析有误,此时请手动设置阈值线,但需确保设置的阈值线在指数扩增区,如通常 Threshold 设置为 0.15,选择 Auto Baseline,点击 Analyze,可看到调整后的结果。
2. 数据可靠性分析:
• 三个平行孔间 Ct 值差应小于 1.0,Ct 值大于 35 的孔除外;
• 阴性对照 NTC 和 NCS 的 CT 值都应大于标曲最i低浓度的 CT 值或根据实验室自身验证结果设定标准;
• 标准曲线相关系数 R2 ≥ 0.98,扩增效率 85%~110% 之间;
• ERC 回收率在 50%~150% 之间;
3. 以 99bp 片段的待测样本检测值为 100%,计算 200bp 片段、307bp 片段的待测样本百分比。
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