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293T细胞残留DNA检测试剂盒

产品简介

293T细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品中间品、半成品及成品中293T细胞DNA的专用试剂盒,本试 剂盒利用Taqman探针原理,定量检测样本中293T细胞残留DNA。检测快速,专一性强,性能可靠,最i低检测限可达到fg水平。

产品型号:HG-HD004
更新时间:2025-03-27
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    293T  细胞残留DNA检测试剂盒(qPCR-荧光探针法)说明书

货号: HG-HD004

293T细胞残留DNA检测试剂盒


产品简介:

293T 细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品中间品、半成品及成品中293T细胞DNA的专用试剂盒,本试剂盒利用Taqman探针原理,定量检测样本中293T细胞残留DNA。检测快速,专一性强,性能可靠,最i低检测限可达到fg水平。
配套样品前处理试剂盒(货号为HG-CL100)进行样品的前处理。
检测范围:3×101 fg/μL~3×105 fg/μL

规格:

100 Reactions

产品组成:

组分规格存储条件
293T 细胞DNA定量参考品(30ng/μL)50μL×1 管-20℃
293T Primer&Probe MIX 550μL×1管-20℃
2×qPCR Reaction Buffer 1.2mL×1 管-20℃
DNA稀释液1.5mL×3 管-20℃
ROX High 50μL×1 管-20℃
ROX Low 50μL×1管-20℃

产品储存条件与有限期:

存储条件见上表,有效期18个月。

适用机型(包括但不限于):

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A(博日)
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同机型使用时,请注意选择适配的参比染料 ROX

仪器ROX参比染料
Applied Biosystems®5700,7000,7300,7700,7900HT,StepOneTM,and StepOnePlusTTMROX High
Applied Biosystems®7500,ViiATM 7,QuantStudioTM12K Flex,Agilent Mx3000PTM,Mx3005PTM,and Mx4000TMROX Low
Rotor-GeneTM,DNA Engine OpticonTM,OpticonTM2,Chromo 4TMReal-Time Detector,Mastercycler®ep realplex,
Smart Cycler®,Roche LightCycle®480,Roche LightCycler®Nano,Bio-Rad CFX96,and llumina EcoTM
No ROX

需要准备的耗材与设备:

实验前请准备好下列耗材与设备:
◆1.5mL或2mL无菌低吸附离心管
◆ 与PCR仪适配的96孔qPCR板或八联排管
◆ 1000μL,200μL,10μL无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 荧光定量PCR仪
◆ 水浴锅/金属浴

◆ 离心机
◆ 震荡器
◆ 各规格移液器(如1000μL,200μL,10μL,2.5μL等)
◆ 磁力架

实验步骤:

一、 样品前处理

详见样品前处理试剂盒(货号为HG-CL100)操作说明书。

二、 qPCR操作步骤

1. 定量参考品及NCS、NTC的制备
 1.1 定量参考品:取出Human DNA定量参考品、DNA稀释液置于冰上融化;待完i全融化后,轻微振荡混匀,瞬时离心;
 1.2 取 6 支干净的1.5mL离心管,分别标记为ST0,ST1,ST2,ST3,ST4,ST5;
 1.3 标准品稀释过程如下表


标准品代号 稀释体积 浓度(fg/μL)
ST010μL 293T DNA定量参考品 + 90μL DNA稀释液3 × 106
ST110μL ST0 + 90μL DNA 稀释液3 × 105
ST210μL ST1 + 90μL DNA 稀释液3 × 104
ST310μL ST2 + 90μL DNA 稀释液3 × 103
ST410μL ST3 + 90μL DNA 稀释液3 × 102
ST510μL ST4 + 90μL DNA 稀释液3 × 101










 1.4 NCS 的制备:取100μL DNA稀释液与样品同时进行前处理,纯化洗脱后的产物即为NCS。
 1.5 NTC 的制备:100uL DNA稀释液;
 1.6 加标回收ERC:建议90uL样品+10uL ST3,也可根据实际情况按照其他方式制备。
2. q-PCR 反应液的制备和加样
 2.1 根据所需检测的标准样品和待测样品数量(一般做 3 个复孔),计算所需孔数:
       反应孔数 =(5 个浓度梯度的标曲 +2 个阴性对照 NTC 和 NCS+ 待测样品)×3
 2.2 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR Mix 总量:
       qPCR Mix=(反应孔数 +2 或 3)× 15μL(2 或 3 为操作损失量)
 2.3 将所需试剂置于冰上融化,轻微振荡混匀,按下表所示配制 qPCR Mix。

组分单孔反应(μL)
2x qPCR Reaction Buffer10
Human Primer&Probe Mix 4.6
ROX*0.4
总体积15

qPCR Mix配制表

*请对应机型选择适配的ROX;若机型适配为no ROX,请加入等体积的去离子水(要求无核酸及核酸酶污染)。


3. 将所需试剂置于冰上融化,轻微振荡混匀,按下表所示加样(总体积20μL):

参考品15μL qPCR Mix +5μL ST1/2/3/4/5
阴性对照15μL qPCR Mix +5μL NTC/NCS
待测样品15μL qPCR Mix +5μL待测样本

各反应孔加样示例

4.实验需使用qPCR实验专用的八联管或者96孔板进行反应,需去除反应体系中的气泡,并离心将液体离至管底准备反应。
5.反应孔排版示例


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
AST1ST1ST1





S1S1S1
BST2ST2ST2





S2S2S2
CST3ST3ST3





S3S3S3
DST4ST4ST4








EST5ST5ST5








F








ERC -S1ERC -S1ERC -S1
G



NTCNTCNTC

ERC -S2 ERC -S2 ERC -S2
H



NCS NCS NCS

ERC -S3ERC -S3ERC -S3

96孔板排版示例

三、 qPCR反应程序和参数设置

(以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例。)

1.创建实验反应程序,设置两步法反应程序如下表:

Stage1预变性Reps:195℃2min
Stage2循环反应Reps:4095℃15s
60℃30s

2.创建实验反应板,点击Select Fluorophores选择荧光FAM;在反应板图表中,选择样品孔,在Sample Type中下拉选择Unknow,勾选荧光FAM,Target Name命名为Human-DNA;输入每个样品的重复次数及Sample Name;
3.在反应板图表中,选择标曲孔,在Sample Type中下拉选择Standard,勾选荧光FAM,Target Name命名为Human-DNA;输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。分别在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5的Concentration一栏赋值为3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01(单位为fg/μL);
4.点击Run界面“Start Run"按钮进行PCR测定。

四、 qPCR结果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例
1. 点击资料分析视窗Quantitation,可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、扩增效率(Effect)、R2。
2. 在视窗Quantitation Data 中,SQ Mean 一栏可读取无模板对照NTC、NCS、待测样本的检测值,单位为fg/μL。
3. 数据可靠性评估:
• 三个平行孔间Ct值差应小于1.0,Ct值大于35的孔除外;
• 阴性对照NTC和NCS的CT值都应大于标曲最i低浓度的CT值或根据实验室自身验证结果设定标准;
• 标准曲线线性相关系数R2≥0.98,扩增效率85%~110%之间;
• ERC回收率在50%~150%之间(加标回收率=ERC/(0.9*样品+0.1*ST3)。

注意事项:

1. 本试剂盒已通过稳定性(冻融等因素)的验证,无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品(参考品和待测样品等)的配制环境需区分区域,不可在一个区域内操作,配制人员需穿戴整齐,戴
好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头,避免交叉污染,避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法,全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证优良检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测,以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责,不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责,请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量,
预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用,不用于临床诊断。



293T细胞残留DNA检测试剂盒产品订购,请联系柏莱源(天津)生物科技有限公司!

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现货供应:公司库存充足,可快速发货,减少用户等待时间。

效期保障:严格把控产品质量,确保试剂效期新鲜,保障实验结果的可靠性。

专业技术支持:提供详细的实验方案和技术指导,帮助用户优化实验条件,提高实验成功率。

定制化服务:根据用户需求,提供个性化的产品和服务解决方案。

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