人肿瘤坏死因子 (TNF-α) ELISA 检测试剂盒说明书

货号：HG-TA001

产品简介：

本试剂盒采用双抗夹心酶联免疫检测(ELISA)法，将人TNF-a标准品和待测样本加入预包被抗人 TNF-a抗体的酶标板，然后加入稀释后的生物i素标记的人 TNF-a检测抗体，最后加入 Streptavidin-HRP，形成抗体+抗原+抗体-Biotin+ SA-HRP 复合物，洗板后加入 TMB 显色液显色。TMB 在 HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的人 TNF-α 的量呈正相关。

检测范围: 1.37~1000pg/mL

灵敏度:0.21 pg/mL

规格：

96T

应用：

适用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

试剂盒组成：

备 注:所有组分存储温度均为 2~8℃，有效期12个月。

需自行准备的材料

◆酶标仪

◆去离子水

◆恒温培养箱

◆全新滤纸

◆微量移液器及吸头

◆涡旋振荡器

实验前准备

1.所有试剂以及待测样本需要恢复室温(18~25°C)。所有试剂现配现用。

2.1x 洗液配制：浓缩洗液平衡至室温（18-25℃），不要有结晶。混匀后根据用量，取适量用超纯水按1：9的比例，将10x洗液稀释10倍，最终得到1x洗液。

3.标准品的配制:

S1至 S7 和 S0 用于血清和血浆。

其他类型样本，用缓冲液(SPB,样品基质)制备标准曲线，例如细胞培养上清液、组织研磨液、细胞裂解物等。尿样使用AB(检测缓冲液)制备标准曲线。

人TNFa标准品S(10000pg/mL)30μL+270μLSPB作为高标准(1000 pg/mL)，每个稀释试管中加入 200 μLSPB,使用高标准品按 1:2 梯度稀释。每一步稀释必须充分混匀。SPB用作零标准(0pg/mL)。

操作步骤

使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温(18~25°C)。建议所有的标准品和待检样本进行双复孔测定。

1.试剂准备:提前准备好各种待测试剂、稀释好的标准品和待测样本。

2.酶标板条确定：计算待测样本和标准品所需酶标板条，将酶标条从铝箔袋取出，剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存。

3.每孔加入 50uL 检测缓冲液。

4.样本及检测抗体孵育：每孔加入50 μL标准品和待测样本，确保15 min内完成点样。再向每孔加入50 μL 检测抗体。用封板膜封板，置于恒温孵育器，500转/分钟、25℃孵育1小时。

5.洗板：弃去孔中液体，加入1×洗液（300 μL/孔）洗板4次，拍干酶标板中残留液体。

6.酶结合物孵育：将酶结合物加入酶标板中，100 μL/孔，用封板膜封板，置于恒温孵育器，500转/分钟、25℃孵育30分钟。

7.洗板:同步骤 5。

8.每孔加入100 μL显色底物TMB，室温（18-25℃）孵育15~20分钟。

9.终止:每孔加入 100 uL终止液，轻轻震动酶标板至显色均匀。

10.读值:20 min 内读取 450nm/630nm 波长处的吸光度值。450nm 作为检测波长，630nm 作为参比波长。

结果处理

1. 标准曲线OD处理（见下例，仅为示例，具体以实际测定为准）

2. 标准品理论浓度与对应 OD 值以四参数进行拟合，得到标准曲线(如下图所示)。

注意事项

1.样品首i次检测，建议进行至少3个连续倍数的稀释，以在标准曲线范围内产生至少一个稀释后样品。

2.试剂按标签说明储存，使用前室温(18-25°C)平衡。

3.包被酶标板使用前，请平衡至室温(18-25°C)再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中密封，4℃可保存一个月其余不用试剂应包装好或盖好。

4.实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。

5.使用前检查试剂盒内各种试剂。试剂稀释、加样和终止反应应充分混匀或摇匀对实验结果尤为重要。

6.洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在洁净的纸中上充分拍干，直至看不到水印。勿将纸巾直接放入反应孔中吸水。

7.底物显色液对光敏感，避免长时间暴露于光下，避免与金属接触影响结果。

8.本产品为一次性使用的试剂盒，请在效期内使用。

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