CRS 细胞因子 ELISA  检测试剂盒说明书

货号： HG-HC001

产品简介：

本实验采用双抗夹心法半定量分析血清、血浆及细胞培养上清中人表达的CAR-T/CRS(细胞因子释放综合征)中分泌的细胞因子(IL2,IL6,IL10,IFN-y)。
将人IL-2、IL-6、IL-10 和 IFN-y特异性抗体预先包被在微滴板上。将混合物和样品移入孔中，任何目标细胞因子都被固定的特异性抗体结合。孵育和洗涤步骤结束后，每孔加入混合抗体-偶联物孵育。洗去未结合的物质后，将 HRP 偶联物加入孔中孵育。 彻i底清洗孔，去除所有未结合的 HRP 偶联物。在初始步骤中，将 TMB 底物添加到孔中，颜色根据目标细胞因子的数量成比例发展。通过加入终止液停止显色，并在波长450nm处测量荧光强度。将样品的 OD值(450nm)与标准曲线进行比较，测定样品中 CART/CRS 细胞因子的浓度。

检测范围:

IL2: 15.625-500 pg/mL

IL6: 31.25-1000 pg/mL

IL10:15.625-500 pg/mL

IFN -y: 15.625-500 pg/mL

定量限:

IL2: 15.625 pg/mL

IL6: 31.25 pg/mL
IL10: 15.625 pg/mLIFN-y: 15.625 pg/mL

规格：

96T

试剂盒组成和储存信息：

备 注:在保质期前使用。如果按照上述方法保存，打开的试剂盒可保持活性8周。

需自行准备的材料

（1）酶标仪，可读取 450nm 波长

（2）去离子水或蒸馏水

（3）移液器和移液器吸头

（4）多通道移液器储液槽

技术要点和注意事项

1.穿戴好防护手套、防护i服、防护眼镜和保护面部，尤其是处理血液或体液样本;

2.将试剂盒中的 100X 抗体偶联混合物保存在-20°℃，其他组分储存在 2-8°C;

3.在开始分析程序之前，携带所需的所有试剂和孔板条至室温(20-25°C);

4.未使用的孔板必须储存在密封的箔袋中，温度为2-8°C;

5.所有试剂必须混合而不起泡，并在使用前短暂旋转所有小瓶;

6.如果在 10X 洗涤缓冲液或稀释缓冲液中观察到晶体，则将其加热至 37℃℃，直到晶体完i全溶解;
7.尽量减少洗涤步骤之间的滞后时间，以确保板在测定过程中不会变得完i全干燥;

8.使用前确保试剂完i全重构和稀释;

9.注意不要污染混合的显色液。不要将混合的显色液暴露在玻璃、箔或金属上。如果溶液在使用前呈蓝色，请勿使用;

10.所有试剂在使用前必须混合并且无气泡;

11.在添加不同的试剂或样品之间更换移液器吸头;

注意:

1.不要使用溶血、黄疸或血脂标本。

2.含有叠氮i化钠的样品不应用于测定。

3.采集血清/血浆时，避免干扰白色肉质层样本。

4.为了获得每个细胞因子的数据，需要>0.2 mL的样品来完成一次检测。建议有更大的容量，以防重复实验。

需试剂配制

1.1X 洗涤缓冲液:将 10X 洗涤缓冲液稀释到蒸馏水中，得到 1X 洗涤缓冲液。(例如，在 450 毫升蒸馏水中加入 50 毫升 10X 洗涤缓冲液，最终体积为 500 毫升)1X洗涤缓冲液在 2-8°℃下稳定达4周。使用前充分混合。
2.1X 抗体稀释缓冲液:将 10X 抗体稀释缓冲液稀释到蒸馏水中，得到 1X 抗体稀释缓冲液。(例如，在 90mL 蒸馏水中加入10mL10X洗涤缓冲液，最终体积为 100mL)1X抗体稀释缓冲液在 2-8℃下稳定达4周。使用前充分混合。
3.1x抗体偶联混合物:建议使用前立即配制好本试剂，配制后 20 分钟内使用。将 100X 抗体偶联混合物稀释到 1X 抗体稀释液中，得到 1X 检测抗体溶液。(例如:100X 抗体偶联混合物浓缩液 12uL+稀释缓冲液 1188uL)
4.1xHRP-链霉亲和素溶液:建议使用前立即配制本试剂，配制后 20 分钟内使用。将 1000XHRP-链霉亲和素溶液浓缩溶液稀释到 1X抗体稀释缓冲液中，得到 1X HRP-Streptavidin 溶液缓冲液。(例如 1000X HRP-链霉亲和素溶液浓缩溶液 1uL+稀释缓冲液 999uL)

5.样品:测定前用等体积的样品稀释液稀释血清和血浆样品(1:1，稀释系数=2)。如果最初的分析发现样品中含有高于最高标准的蛋白质，可以用样品稀释液稀释样品，然后重新分析样品。为了计算浓度，必须考虑到稀释系数。细胞培养上清可直接测定。(建议预先检测，确定合适的稀释系数)。

6.混合标准:

A.加入 1mL 样品稀释液，重新配制冻干后的标准液，得到不同浓度的4种细胞因子的高浓度原液(见下表)。短暂的涡流，让标准品静置至少 15 分钟，轻轻搅拌，以确保标准品完i全溶解，然后再进行一系列稀释。
B.定量分析时，使用上述高浓度标准液和稀释 32 倍的低浓度标准液，最多 22 个测试样品。如果需要更准确的结果，用标准/样品稀释液缓冲液进行两倍连续稀释可以产生更准确的标准曲线。但是，测试样本的数量将会减少。
4 种细胞因子在不同稀释度标准液中的浓度如下：

试验过程

所有材料在使用前应平衡至室温(RT,20-25°C)。

1.向包被酶标板中加入 100uL 标准品混合物或稀释后的样品。注:为了得到4种细胞因子在 22 个测试样品上的近似浓度，可以按以下方案加入低浓度标准混合物(S1，高浓度混合物 1:32)、高浓度标准混合物(S2)和测试样品(T1至 T22):

2.用封板膜封板后，室温(18~25°C)孵育2小时。

3.弃去各孔内液体，用 1x 洗涤液注满微孔(300 uL/孔)，静置 30 秒后弃去孔内液体;重复4 次，每一次洗板完成后在滤纸上拍干。

4.每孔加入 100uL的 1X 抗体偶联混合物。

5.用封板膜封板后,室温(18~25°C)孵育1小时。

6.洗板，同步骤 3。

7.每孔加入 100 μL 的 1000XHRP-链霉亲和素溶液。用封板膜封板后，室温(18~25℃C)孵育1小时。

8.洗板 7次，同步骤 3。

9.每孔加 100 μL 显色液。用封板膜封板后，在室温(18~25°℃)下黑暗中孵育 10-20 分钟。

10.立即在每孔中加入 100uL终止液，轻拍平板使其混合均匀。溶液的颜色应由蓝色变为黄色):

11.立即用微孔板读取仪在 450nm 处读取外径。建议在加入终止液后 30 分钟内读取吸光度。

标准曲线

结果处理

1.计算每组标准品和样品的平均吸光度值。

2.在半定量分析中，从高浓度标准液和低浓度标准液的 OD 读数可以得到4种细胞因子的4条粗曲线。细胞因子的近似浓度可由粗曲线得到。由于标准曲线可能不是完i全笔直的，由两个点得到的粗糙曲线得到的浓度可能不是很准确。
3.为了获得更准确的结果，在生成标准曲线时可以使用更多的稀释点。4参数物流是结果计算的首i选方法。其他数据约简函数可能会给出略有不同的结果。

4.如果样品已被稀释，则必须根据样品制备程序，用适当的稀释系数进一步转换从标准曲线上读取的浓度。

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