AO/PI双染法——荧光染料如何精准区分死活细胞？

当需要更高精度的细胞活性数据，或样本中存在红细胞、细胞碎片等干扰物时，AO/PI双染法是优于台盼蓝染色的“金标准"方法。它结合了两种荧光染料的特性，结果清晰可靠。

染色原理

AO（吖啶橙）：是一种膜通透性荧光染料，能够自由穿过所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞膜，与细胞核内的DNA结合后，在蓝光激发下发出绿色荧光。

PI（碘化丙啶）：是一种膜不通透性荧光染料，只能进入细胞膜受损的死细胞内，与DNA结合后发出红色荧光。

当两种染料同时存在时：

 活细胞：细胞膜完整，PI无法进入。只有AO进入细胞，细胞核呈现绿色荧光。

 死细胞：细胞膜破损，AO和PI均可进入。当两者同时与DNA结合时，由于能量共振转移，PI的红色荧光会掩盖AO的绿色，最终细胞核呈现红色荧光。

操作流程与仪器

 染色：将AO和PI按一定比例（通常预混或依次加入）与细胞悬液混合，室温避光孵育几分钟。

 检测：

 荧光显微镜：将染色后的细胞滴片，在荧光显微镜下观察。绿色细胞为活细胞，红色细胞为死细胞，清晰可辨。此法可直接观察细胞形态，但计数相对耗时。

 流式细胞仪：将细胞悬液上流式细胞仪检测。仪器可快速检测成千上万个细胞的荧光信号，并给出精确的活细胞/死细胞比例，同时可分析细胞大小、颗粒度等参数，效率高、客观性强。

技术优势与局限

优势：

 准确性高：有效排除红细胞（无核，不染色或染色弱）和细胞碎片（无完整细胞核，荧光信号弱）的干扰。

 双荧光验证：活/死细胞信号对比鲜明，结果直观可信。

 可结合流式：实现高通量、多参数的精确分析。

局限：

 设备依赖：需要荧光显微镜或流式细胞仪，并非所有实验室都具备。

 成本较高：荧光染料和配套耗材比台盼蓝贵。

 操作稍复杂：需要避光操作和仪器使用经验。

应用建议

AO/PI染色特别适用于：含有红细胞的样本（如组织消化液）、需要高精度数据的药物筛选实验、流式细胞术中的死活细胞区分、以及作为发表论文的可靠数据支撑。

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