CCK-8试剂盒进行细胞增殖检测的步骤是怎样的？

CCK-8试剂盒是一种基于WST-8的试剂盒，用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测等，具有使用方便，检测快速，灵敏度高，重复性优于MTT法，毒性小，适合于高通量药物筛选等大规模实验应用的优点。以下是使用CCK-8试剂盒进行细胞增殖检测的步骤：

一、细胞增殖分析

1.培养细胞并将其接种到96孔板中。

2.在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。

3.配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。

4.每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。

5.在CCK-8试剂盒中加入10μL的CCK-8溶液。

6.在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养0.5-4小时。

7.用酶标仪在450 nm处测量吸光度。

8.用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。

二、细胞毒性分析

1. 制备细胞悬液：细胞计数

2. 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。

3. 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4. 加入不同浓度的毒性物质

5. 37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。

6. 加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

7. 培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

8. 测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

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