直扩PCR技术的使用场景及常见问题

直扩/直接PCR——Direct PCR，一种不需要额外提取DNA就能够实现体外DNA扩增的技术，省去提取基因组DNA的繁琐程序，可以直接应用于PCR的快速检测。直扩PCR最早应用的领域是动植物领域，比如鼠、猫、鸡、兔、羊、牛等动物的血液、组织和毛发；植物的叶片和种子等，用来研究基因分型、转基因、质粒检测、基因敲除分析、DNA来源鉴定、物种鉴定、SNP分析等领域。

这些领域有一些共同的特点，那就是目标基因的含量比较高，核酸提取麻烦，所以直扩PCR不仅能够节省时间，对结果的影响很小，同时也能节省成本。本文就一起来了解一下直扩PCR技术的使用场景及常见问题。

在做分子实验时，什么情况下建议使用直扩PCR而不是常规PCR呢？

1.只需要提取样品基因组DNA进行PCR、分子克隆等实验，不需要长期保存DNA。如基因型鉴定、CRISPR-Cas9阳性鉴定等；

2.样品量较大时，做PCR鉴定需要保存阳性样本基因组DNA，也可使用Direct PCR进行样本初步筛选，有利于节约时间、成本；

3.样本量较少，无法使用基因组提取试剂盒提取的样品也可尝试此方法。

直扩PCR常见问题与解决办法

Q1：扩增无目的条带？

A1：

1） 样品

a．裂解样品过多。建议按照说明书取样进行裂解；

b．样品中抑制成分浓度过高。释样品后再取适量作为模板。

2） 引物

a．引物设计不合理；

b．引物降解；

建议用提取的DNA样品作为对照，用试剂盒阳性引物对照进行试验，重新设计引物。

3）  程序：

a．PCR扩增程序不合适。调整PCR程序（优化退火温度：使用降落PCR，梯度PCR，增加循环数至35~40个循环、延伸时间增加等）。

Q2：扩增出现非特异条带？

A2：

1） 引物：

a．引物设计不合理。重新设计引物（从引物5’端延长引物至25~30bp，Tm值65~67℃）；

b．引物浓度过高。降低引物浓度。

2）样品

a．裂解样品过多。建议按照说明书取样进行裂解；

b．样品中抑制成分浓度过高。释样品后再取适量作为模板。

3）  程序：

a．退火。优化退火温度，使用降落PCR，梯度PCR；

b．延伸。减少延伸时间；

c．循环数。降低循环数。

本期内容：直扩PCR技术的使用场景及常见问题

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