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ELISA空白背景高的常见原因和处理方法

更新时间:2023-11-13点击次数:1221

ELISA素来以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用。而它作为经典的免疫检测方法,虽然看似平常但是要真正将该实验做好并不容易,酶标板的读值总是会不尽如人意,可见实操中的各个环节对该实验的检测效果影响较大,如不注意,就会产生一些糟心的实验结果。跟小源一起来总结一下ELISA空白背景高的常见原因和处理方法吧!

常见原因有以下这些:

1)洗板不干净

解决方法:

①充分洗涤:如果洗板的时间不够,会导致抗体残留,阴性对照会显色,尝试延长洗板时间,增加洗板频率,在洗液中添加表面活性剂Tween-20。

在洗板时要保证每步都洗涤,充分拍板直至孔内没有明显的残留液体。

②避免交叉污染:弃去洗液和孵育的抗体时避免交叉污染,移液枪头尽可能一次性使用,拍板的滤纸不要反复使用。

2)显色液变质或者试剂过期

解决方法:检查试剂盒有效期,或使用新的试剂盒并按照说明书要求保存试剂盒。每次用剩下的显色液最好不要回收,或者只回收洗净的容器装的显色液。

3)试剂稀释有误,检测抗体/酶结合物工作液浓度过高

解决方法:按照说明书推荐的稀释倍数稀释抗体。

4)试剂盒组分未平衡

解决方法:试剂盒每个组分都需要平衡至室温后进行实验。

5)混用其他试剂盒试剂

解决方法:保证使用试剂盒内完整的一套试剂进行实验,不同品牌及不同批次间的试剂可能存在不匹配现象,不同批号的试剂不要混用。

6)蒸馏水受酶等污染

解决方法:使用新鲜蒸馏水。

7)培养箱温度超过37℃或反应时间过长

解决方法:孵育时间过长、温度过高可能会导致非特异性结合增加,从而造成本底增高。检查恒温箱,确保孵育温度稳定在37℃,按照说明书的反应时间进行孵育。

8)酶标板底部有污渍

解决方法:在加完终止液之后,检测之前,用75%乙醇浸润的脱脂棉球擦拭酶标板底部,确认没有污渍之后再检测。

9)洗液被污染

解决方法:洗液现配现用,长期放置会析出,也可能会污染,导致背景偏高。

10)包被的抗原被污染

解决办法:仔细回想操作过程,换新的抗原包被。

11)封闭液、封闭时间、封闭液的浓度

解决办法:封闭液(BSA)可能会与抗体产生交叉反应。封闭液的浓度偏低、封闭时间过短导致封闭不che底,抗体与酶标板结合,可能也会导致背景偏高,因此可以适当调整封闭液的浓度和时间以降低背景。

12)抗体质量差或选择的抗体不合适

解决办法:抗体质量不高,特异性不好可能会与封闭液(BSA)产生交叉反应,可以用0.8%明胶(明胶不含有血清成分)代替。

若选择多克隆抗体孵育,可能会与酶标单抗产生交叉反应,导致背景增加,最好选用与酶标单抗同种属的多克隆抗体。

13)酶标仪设置参数有误

解决办法:检查酶标仪设置的波长,不同波长下样品的吸光光度值也会有很大的差别,按照说明书要求设置参数。

本期内容:ELISA空白背景高的常见原因和处理方法

下期内容:酶联免疫吸附测定ELISA实验类型有哪些?


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