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免疫共沉淀Co-IP实验步骤

更新时间:2023-11-07点击次数:642

Co-IP(免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation)是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术,能够特异性富集所研究的目的蛋白。


免疫共沉淀Co-IP实验步骤

细胞转染

1.铺细胞,转染细胞。本次转染的两个蛋白分别带有FLAG和HA标签。


裂解细胞

2.去除培养基,PBS吹下细胞,离心去上清。将细胞沉淀转移到1.5mlEP管中,PBS洗,离心去上清,加1ml裂解液。


3.冰上孵育40min,每10min震荡一次。


4.超声破碎细胞结构和打断染色质。冰上操作。

这个功率和时间要你自己摸索,不同细胞不同机器都会有差别,一般的国产机器对10^7细胞用20%功率超声4分钟左右即可比较充分(超声2秒,停2秒)。直到溶液相对比较清澈,没有丝状DNA


5. 4度,12000 rpm/min离心10mins


6.转移上清(上清体积会有所增加,可能是因为细胞溶解了)到新的预冷的试管中。取50ul上清作为input


7.将剩余样品分为两份,其中一份加入FLAG(MOUSE)抗体1uL(转染的蛋白带有FLAG标签),一份加入相应宿主的普通IgG(mouse),4℃轻摇过夜,使抗体和目标蛋白充分结合。


抗体与beads的结合

8.beads吸出至新管(每个107样品准备40ul beads悬液,约含20ul Protein A/G beads,细胞较少时可适当减少,最少10ul悬液否则后续操作会很困难)用2倍体积(PBS+0.1%triton-100)洗涤3次,去上清。3000rpm离心1min基本可以充分沉淀,转速时间可调。


9.用等体积的buffer重悬beads


10.在每个样品中加入20ul beads悬液,4℃轻摇2小时,使抗体和beads充分结合。


样品的收集和洗涤

11.IP过后的样品离心 3000rpm 1min


12.将上清转移至新管 标记为Flow through


13.加入500ul (PBS+0.1%triton-100)洗涤beads 4℃轻摇5min  3000rpm 1min 弃上清。


14.洗涤三次,最后一次尽量去除上清。


样品的洗脱

15.30-100ul裂解液重悬beads,具体体积根据SDS-PAGE需求自定。


16.将样品和input中加入合适体积的loading buffer混匀,必要时可以将Flow through进行制样检测。


17.95℃-100℃热变性10-15min,冷却后冻存备用。


18.SDS-PAGE和WB检测。IP用的是FLAG抗体,检测HA。


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