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如何让细胞“冻”起来?

更新时间:2023-11-11点击次数:253

在细胞实验中,我们通常通过冻存的手段让细胞代谢变得缓慢,从而达到长期保存或保种的目的,以供后续实验的使用,那么如何让细胞“冻"起来使之不变与永恒逐渐成为一个热门话题,接下来一起来探究一下吧!

冻存细胞.png

【低温储存】

随着细胞被冷冻至冰点以下,悬液中冰晶和溶质的浓度有所增加。如果冷却过程中,胞内水分可以渗出细胞,则可以减少胞内冰晶。通常1℃/min的降温速度可以促进此过程。但是,水分的丧失会导致细胞收缩,当这种收缩达到一定程度,又会导致细胞活性的剧烈下降。冷冻保护剂,如甘油或者二甲基亚砜(DMSO,货号:D2650),可以缓解这种效应。细胞冻存的标准程序是在含有冷冻保护剂的培养基中,将细胞缓慢冷冻至–70℃,然后将冻存管转移到液氮中以保持低于–130℃的环境。

D2650.png

冻存液

5%-10%的甘油和DMSO是最常见的冻存保护剂。虽然DMSO对细胞有毒性,但是与甘油相比,其渗入细胞的速度更快,而且冻存重复性更好(而且细胞复苏效率更好)。但是,DMSO一方面会导致某些细胞(如HL-60早幼粒细胞)分化,另一方面对某些细胞(如HBE4-E6/E7肺上皮细胞)的毒性也过大。对于这些细胞,则应使用甘油。甘油可以通过高压蒸汽灭菌,而DMSO只能通过过滤除菌。DMSO或者甘油至少应达到试剂级(或者更高级别,如细胞培养级),并且分装,避光保存。

【冻存管】

冻存管材质分为两种:玻璃或者塑料。玻璃管更难操作,但更适合珍贵细胞的长期保存,而且一旦适当密封,其安全性也更高。

程序降温盒

有很多方法可以实现1℃/min的降温速度。电脑控制的可编程电子降温系统是很好的方式,可以精确保持降温速度。

比较经济的方式是将冻存管放置于冻存盒中,在低于–70℃的冰箱中冻存24小时。已有一些商业化冻存盒产品能够非常接近1℃/min的理想降温速度。或者可以将冻存管放置于壁厚大约15mm的1L容积的聚苯乙烯盒子中,并填充入纸、棉绒或者泡沫起到隔热的作用。

液氮罐冻存

长期保藏所需要的超低温(低于 -130℃)环境,可以使用低温冰箱,更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮储存分为两种方式:将冻存管浸入液氮中或者悬于液氮液面以上的蒸气中。液体体系需要更多的液氮,后期维护简单,但是液氮有可能进入密封不严的冻存管中,并在细胞复苏时发生冻存管爆炸。

因此,强烈建议保存在液氮蒸气中。液氮蒸气会在罐内产生一个垂直的温度梯度。液氮底层为-196℃,而上层温度会受到液氮余量和液氮罐敞开时长的影响。为保证储存安全,请确保罐中液氮充足,以使上层温度低于-130℃。所有的储存系统都应配备温度报警装置。

冻存程序

以下程序适用于大多数细胞,如果必要,可以适当调整。冻存培养基的配方请参考其细胞说明书。


1.冻存前先检测细胞是否受到细菌、真菌、支原体和病毒的污染。通常冻存后10-14天才能得到污染检测结果,如果确定有污染,应将该细胞销毁。


2.冻存培养基由wan全培养基和5% DMSO(sigma D2650)组成。由于DMSO的溶解会放热,所以不能向细胞悬液中直接加入未稀释的DMSO。


3.以温和速度(125g×10 min)离心收集细胞,并以1×10*6-5×10*6活细胞/ml的密度重悬细胞。继续培养细胞直到复苏后细胞活性得以确定。


4.在冻存管上标记好细胞名称,编号和冻存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml细胞悬液(视冻存管体积)并密封。


5.室温条件下,将细胞在冻存培养基中平衡15-40 min(勿超)。这段时间中,可以将细胞悬液等分加入冻存管中。40min后,细胞活性可能会受到DMSO的影响而下降。


6.将冻存管置于已预冷至4℃的程序降温盒,并将降温盒置于-70℃(或更冷)的冰箱中至少24小时。或者,使用已预冷至4℃的可编程电子降温系统以1℃/min的速度将冻存管降温至-40℃以下,然后迅速降至-130℃。


7.将冻存管迅速转移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常,冷冻的细胞会以10℃/min的速度升温,一旦达到-50℃以上,细胞会剧烈受损。


8.记录冻存位置和过程细节等信息。


9.置于-130℃ 24小时后,取出一只冻存管并复苏,以测定细胞活性和是否污染。

本期内容:如何让细胞“冻"起来?

下期内容:细胞实验中为什么要“慢冻快融"呢?





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