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Human残留DNA片段分析检测试剂盒

产品简介

Human残留DNA片段分析检测试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理,定量检测样本中 Human 宿主 DNA 残留片段大小分布,本试剂盒设计三种不同的扩增片段(99bp、200bp、307bp),用 Human DNA 定量参考品分别对不同的扩增片段制作标曲,通过不同大小片段的比值分析样本中 Human 残留 DNA 的片段分布情况。

产品型号:HG-HF001
更新时间:2025-03-27
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    Human 残留DNA片段分析检测试剂盒 (qPCR-荧光探针法)说明书

    货号:HG-HF001

    Human残留DNA片段分析检测试剂盒

    产品简介:

    本试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品及成品中 Human 宿主 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。
    本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理,定量检测样本中 Human 宿主 DNA 残留片段大小分布,本试剂盒设计三种不同的扩增片段(99bp、200bp、307bp),用 Human DNA 定量参考品分别对不同的扩增片段制作标曲,通过不同大小片段的比值分析样本中 Human 残留 DNA 的片段分布情况。

    规格:

    3 × 100 Reactions

    产品组成:

    序号组分装量/管数量存储条件
    1 Human Primer&Probe MIX-99300μL1 -20℃,避光保存
    2 Human Primer&Probe MIX-200300μL1 -20℃,避光保存
    3 Human Primer&Probe MIX-307300μL1 -20℃,避光保存
    4 Human DNA定量参考品60μL1 -20℃
    5 2×Probe qPCR Mix1.25mL4 -20℃
    6 DNA稀释液1mL4 -20℃
    7 IPC Mix450μL1 -20℃,避光保存
    8 ROX High*200μL1 -20℃,避光保存
    9 ROX Low*200μL1 -20℃,避光保存

    产品储存条件与有限期:

    -20℃储存,有效期 18 个月。

    适用机型(包括但不限于):

    ◆ ABI PRISM 7500
    ◆ FQD-96A(博日)
    ◆ CFX96(Bio-Rad)
    ◆ Roche Light Cycler 480
    配合不同机型使用时,请注意选择适配的参比染料 ROX

    仪器ROX参比染料
    Applied Biosystems®5700,7000,7300,7700,7900HT,StepOneTM,and StepOnePlusTMROX High
    Applied Biosystems®7500,ViiATM 7,QuantStudioTM12K Flex,Agilent Mx3000PTM,Mx3005PTM,and Mx4000TMROX Low
    Rotor-GeneTM,DNA Engine OpticonTM,OpticonTM2,Chromo 4TMReal-Time Detector,Mastercycler®ep realplex,
    Smart Cycler®,Roche LightCycle®480,Roche LightCycler®Nano,Bio-Rad CFX96,and llumina EcoTM
    No ROX

    需要准备材料:

    ◆ 1.5mL 或 2mL 无菌低吸附离心管
    ◆ 离心机
    ◆ 荧光定量 PCR 仪

    ◆ 与 PCR 仪适配的 96 孔 qPCR 板或八联排管
    ◆ 震荡器
    ◆ 1000μL,200μL,10μL 无菌低吸附带滤芯枪头
    ◆ 各规格移液器(如 1000μL,200μL,10μL,2.5μL 等)

    操作步骤:

    一、Human DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

    用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 Human DNA 定量参考品(浓度为 3ng/μL)进行梯度稀释,稀释浓度依次为 3 × 105fg/μL、3 × 104fg/μL、3 ×103fg/μL、 3 ×102fg/μL,3 × 101 fg/μL。具体操作如下:
    1. 将试剂盒中 Human DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上,待完i全融化后,轻微振荡混匀,短暂离心将液体甩至管底。
    2. 取 5 支干净的 1.5mL 离心管,分别标记为 ST1,ST2,ST3,ST4,ST5。
    3. 在 ST1,ST2,ST3,ST4,ST5 管中分别加入 180μL DNA 稀释液。
    4. 按表 2 依次进行 5 次稀释操作,每次稀释后确保充分混匀后再进行下一个梯度的稀释。如先取 20μL Human DNA 定量参考品加入步骤 3 准备好的 ST1 管中,轻微振荡充分混匀,短暂离心将液体甩至管底;然后再取 20μL ST1 中的标准品加入步骤 3准备好的 ST2 管中……依次稀释。

    表 2. 标准品稀释过程

    标准品代号稀释体积浓度
    ST1180μL DNA 稀释液 +20μL Human DNA 定量参考品3 × 105 fg/μL
    ST2180μL DNA 稀释液 +20μL ST13 × 104 fg/μL
    ST3180μL DNA 稀释液 +20μL ST23 × 103 fg/μL
    ST4180μL DNA 稀释液 +20μL ST33 × 102 fg/μL
    ST5180μL DNA 稀释液 +20μL ST43 × 101 fg/μL

    二、阴性质控 NCS 及 NTC 的准备

    取 100μL DNA 稀释液加入 1.5mL 干净的离心管中,标记为阴性质控 NCS。
    阴性质控 NCS 可和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控 NCS 纯化液。
    qPCR 反应加样时,加入 10μL DNA 稀释液即为阴性对照 NTC。
    注:为了满足同步进行三个不同扩增长度的片段分析检测需求,样本前处理中 DNA 洗脱体积需要≥ 100μL。

    三、加标体系制备

    加标回收 ERC:建议 90uL 样品 +10uLST3,也可根据实际情况按照其他方式制备。
    加标回收率计算:ERC 回收率在 50%~150% 之间(加标回收率 =ERC/(0.9* 样品 +0.1*ST3)

    四、qPCR 反应液的制备

    1. 从冰箱里取出各试剂置于冰上。
    2. 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量,计算所需反应孔数,一般做 3 个重复孔 / 样。即反应孔数 =(5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS + 待测样本数量)×3。
    3. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR 反应液总量: qPCR 反应液 =(反应孔数 +2)× 20μL(含有 2 孔的损失量)。
    4. 待各试剂放在冰上充分融化后,参考表 3、4、5 所示并组合反应孔数准备对应扩增片段的 qPCR 反应液,并充分混匀。

    表 3. 99bp qPCR 反应液配制表

    组分单孔反应
    2×Probe qPCR Mix15μL
    Human Primer&Probe MIX-993μL
    IPC Mix1.4μL
    ROX*0.6μL
    总体积20μL

    表 4. 200bp qPCR 反应液配制表

    组分单孔反应
    2×Probe qPCR Mix15μL
    Human Primer&Probe MIX-2003μL
    IPC Mix1.4μL
    ROX*0.6μL
    总体积20μL

    表 5. 307bp qPCR 反应液配制表

    组分单孔反应
    2×Probe qPCR Mix15μL
    Human Primer&Probe MIX-3073μL
    IPC Mix1.4μL
    ROX*0.6μL
    总体积20μL

    * 请对应机型选择适配的 ROX;若机型适配为 no ROX,请加入等体积的去离子水(要求无核酸及核酸酶污染级去离子水)。

    五、上样

    1. 将配制的各 qPCR 反应液轻微振荡混匀,短暂离心将液体甩至管底。按 20μL/ 孔加入排版设计(如表 9 示例或按个人设计调整)对应的孔中,选择对应扩增片段参考表 6、7、8 所示加样,加样后每孔总体积 30μL。

    表 6. 99bp 各反应孔加样示例

    ST-99bp20μL99bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
    NTC20μL99bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液
    NCS20μL99bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液
    待测样本20μL99bp qPCR反应液+10μL待测样本

    表 7. 200bp 各反应孔加样示例

    ST-200bp20μL200bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
    NTC20μL200bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液
    NCS20μL200bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液
    待测样本20μL200bp qPCR反应液+10μL待测样本

    表 8. 307bp 各反应孔加样示例

    ST-307bp20μL307bp qPCR反应液+10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5
    NTC20μL307bp qPCR反应液+10μL DNA稀释液
    NCS20μL307bp qPCR反应液+10μL阴性质控NCS纯化液
    待测样本20μL307bp qPCR反应液+10μL待测样本

    表 9 96 孔板排版示例

    99bp200bp307bp
    ST1ST1ST1S2ST1ST1ST1S2ST1ST1ST1S2A
    ST2ST2ST2S2ST2ST2ST2S2ST2ST2ST2S2B
    ST3ST3ST3S2ST3ST3ST3S2ST3ST3ST3S2C
    ST4ST4ST4S3ST4ST4ST4S3ST4ST4ST4S3D
    ST5ST5ST5S3ST5ST5ST5S3ST5ST5ST5S3E
    S1S1S1S3S1S1S1S3S1S1S1S3F
    NTCNTCNTC
    NTCNTCNTC
    NTCNTCNTC
    G
    NCSNCSNCS
    NCSNCSNCS
    NCSNCSNCS
    H
    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

    & 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对 NTC、1 个阴性质控 NCS、3 个待测样本。每个检测做 3 个重复孔。也可根据自己的使用习惯进行设计排版。

    2. 将 96 孔板用光学膜封闭,轻微震荡混匀,用 96 孔板专用离心机短暂离心装液体全部甩至管底后放入 qPCR 仪中。

    六、上机

    以 ABI 公司 7500 qPCR 仪,软件版本 V2.0.6 为例。
    1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板,taqman 探针法。
    2. 三组 qPCR 反应液创建新检测探针,分别命名为 99bp、200bp、307bp,选择报告荧光基团为 FAM,猝灭荧光基团为 none;创建新检测探针,命名为 IPC,选择报告荧光基团为 VIC,猝灭荧光基团为 none,检测参比荧光为 ROX。
    3. 将板上标准品对应的孔选择为 Standard,分别赋值为 3 x 105、3 x 104、3 x 103、 3 x 102,3 x 101 (单位为 fg/μL),并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5;NTC 选择 Negative Control,NCS 和待测样品孔选择为 Unknow,并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S1、S2、S3。
    4. 设置三步法反应程序:95℃ 5min;95℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 1 min,45 个循环;反应体积 30μL。
    5. 运行 PCR 程序。

    七、qPCR 结果分析

    1. 在 Results 的 Amplification Plot 中,可初步查看扩增曲线的形态是否正常。机器通常会自动设置阈值(Threshold)和基线(Baseline),当 target 设置等不同时可能会出现多个阈值,而导致结果分析有误,此时请手动设置阈值线,但需确保设置的阈值线在指数扩增区,如通常 Threshold 设置为 0.15,选择 Auto Baseline,点击 Analyze,可看到调整后的结果。
    2. 数据可靠性分析:
    • 三个平行孔间 Ct 值差应小于 1.0,Ct 值大于 35 的孔除外;
    • 阴性对照 NTC 和 NCS 的 CT 值都应大于标曲最i低浓度的 CT 值或根据实验室自身验证结果设定标准;
    • 标准曲线相关系数 R2 ≥ 0.98,扩增效率 85%~110% 之间;
    • ERC 回收率在 50%~150% 之间;
    3. 以 99bp 片段的待测样本检测值为 100%,计算 200bp 片段、307bp 片段的待测样本百分比。

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