细胞冻存的步骤与注意事项

为什么培养的细胞要冻存？冻存的通用步骤是什么？有什么注意事项？以上三个问题就是本期我们要探讨的内容，

为什么要冻存？

首先，细胞培养过程中，考虑到细胞株传代次数逐渐增加后，细胞变异的可能性将增大，继续培养的话细胞株可能会出现老化、状态下降、丢失一些该细胞的特性的现象，对后续实验造成影响；

此外，如果该细胞株特别珍贵，属于实验室重要资源，对细胞进行大规模的保存，能有效降低课题项目执行的风险;

最后，就是常见的风险规避问题，正所谓人有失手、马有失蹄，再熟练的实验操作者、再厉害的实验设备也是有出问题的可能，一旦出问题，意味着细胞资源的损失。

基于以上几点，细胞冻存对于一个实验室或个人来说，是非常必要的操作。

细胞冻存的通用步骤

既然了解了冻存的必要性，接下来我们讲一下冻存细胞的通用步骤。这个步骤适用于绝大多数的细胞以及绝大多数的实验室环境，它并不需要特别的试剂耗材。

当细胞培养至对数生长期晚期，但未进入平台期之前，也就是生长密度达到90%以上未到100%之前，此时贴壁生长的细胞依然处于单层细胞状态。将该细胞消化，并进行计数。

然后通过调整细胞悬液体积，将细胞密度调整为2X10^6～2X10^7/mL。与此同时，使用细胞培养级别的DMSO与wan全培养基混合，配制冻存液，冻存液成分的体积比应该为DMSO占20%：wan全培养基80%。

将配置好的冻存液与细胞悬液按照体积1:1的比例进行混合，转移到冻存管内，做好标记，完成密封。

接下来，按照4度半小时、-20度一小时、-80度过夜的顺序逐步将冻存管的温度下降。

如果实验室内有程序降温盒，则可以直接将冻存管放入盒内，实现温度的稳步下降。最后，将冻存管从-80度转移至液氮罐内，进行长期保存。

细胞冻存的注意事项

1 在冻存之前，确保细胞状态良好。包括：细胞生长密度符合上述规定、细胞无污染、细胞形态良好没有变异。

2 DMSO可以溶解部分滤膜，如果要进行过滤，应该选择不会被DMSO降解的滤器，并且操作时务必带手套。

3 冻存管的管盖并不是拧得越紧越好，因为管盖内有O型橡胶圈，拧得太紧会让其变形，造成泄漏。当然，太松也会泄漏。

4 细胞冻存的密度应该要比传代时的密度要高得多，假如传代时的密度是1X10^ 5/mL，那么冻存时可以将密度提高到100倍。

等到了复苏后，再将密度稀释为1/20也依然能保持较高的生长密度，但与此同时，残留的DMSO对细胞的影响则会大大降低。

5 冻存应遵循慢冻，复苏则相反，应快速升温。慢冻的原因是为了避免降温时，细胞内的水分还未来得及脱离细胞，但却形成冰晶，对细胞造成损伤。

但也要注意，慢冻不等于无限制的缓慢降温，因为太慢，也会促成水分形成冰晶。理想的降温速度应该是1度/分钟的下降速度。

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其次，D2650在生物领域的应用非常广泛。它可以用作细胞冷冻保护剂，能保护细胞免受冰晶导致的机械损伤。在细胞培养中，D2650被广泛应用于原代、继代培养和重组的异倍体和杂交瘤细胞系、胚胎干细胞以及造血干细胞的冻存。同时，由于其优秀的溶解性和稳定性，D2650还可以用于聚合酶链式反应（PCR）等化学反应。

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