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蛋白Marker的常见问题解答

更新时间:2023-11-11点击次数:616

蛋白Marker即蛋白分子量标准,是一些已知分子量的蛋白质的混合物,像“尺子"一样用来指示蛋白质条带的大小。

在Western Blot过程中,分子量Marker就像个螺丝钉一样虽然是其中小小的一环,然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。Marker的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小,只有标准量精确无误了,实验结果才有说服力,除此之外,蛋白Marker还有显示转膜是否成功、以及蛋白在凝胶上的电泳程度等作用,因此选择正确的蛋白Marker也是Western Blot实验成功的必要条件之一。我们整理了一些在实验中蛋白Marker的常见问题,快来学习吧!

一、marker一定要都跑出来吗?

比如说说明书上市7条带,其实跑出6条带是正常的,可能是跑的时间不够,如果你的蛋白不是很小的话,可以等溴酚蓝前沿刚跑出胶的时候再关电泳仪,这样应该可以有7条带.有的时候还会跑出5条,不过只要在你的目的蛋白的上下两个带都跑出来了就可以了,不一定非要7条。

二、marker变成笑脸状怎么办?

第一,胶没有压片

第二,胶在板的边缘与中心的胶的流动性可能不同,这个没有办法,跟黏度和表面张力有关。如果各种方法都不能解决上面的现象,个人建议maker换一条道上样,选一条靠近中间的泳道跑一跑。

边缘效应,在边缘两个泳道的样品会这样的。可以试试电泳速度慢点儿......

要么配胶时没压好,胶没配好,要么电泳时电压太大,电渗力强,要么玻板电泳时没夹好,内电泳液是漏的,请逐一排查。

三、marker条带变宽怎么解决?

原因一:上样量过多,应该减少上样量。

对策:加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL(即2-10μg蛋白质)。如果样品很稀上样量可以达到100μL。
原因二:样品溶解不wan全。
对策:

(1)样品应该充分溶解:保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解,上样前最好离心一下,实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液;如果是自行配置标准和未知样品,按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后,将其转移至Ep管,盖上盖子(可以在盖子处加上卡子)后在110度沸水中水浴加热3分钟(可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Ep管直径形同的圆洞,Ep管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止,把薄泡沫塑料板的暴露出Ep管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中,薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面,便于取用和加热,也可避免沸水溅起。

可以一批对于多个Ep管进行不同时间的沸水浴。不要把Ep管扔进沸水浴锅中,盖子可能会被冲开),而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用,则将样品放入零下20度冰箱中储存,需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样,以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
(3)改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解,SDS 用量要充分。
原因:SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不wan全外,凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策:此时只能重新制备凝胶,梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕,速度不宜过快,拔起的方向要垂直于凝胶表面;要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹,在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。


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