悬浮细胞下游实验应用——流式细胞术检测与RNA提取全解析

更新时间：2026-06-09

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悬浮细胞因其在培养液中均匀分布、无需消化即可直接收集的特点，在多种下游实验中具有先天优势。本章节将聚焦悬浮细胞常用的两大下游实验——流式细胞术检测与RNA提取，系统梳理从样品制备到实验完成的核心步骤与关键注意事项。

流式细胞术检测——样品制备与染色流程

流式细胞术是分析悬浮细胞表面标志物、细胞周期、凋亡状态等特性的重要工具。悬浮细胞因无需消化，样品制备更为简便快捷。

首先收获细胞，制备单细胞悬浮液。根据细胞数量和体积，将悬液转移到96孔板、试管或Falcon流式管中。需注意的是，如果细胞未经任何处理直接上机检测，所有步骤应在冰上操作，并使用4℃预冷的试剂，以防止细胞表面蛋白的内化。

确定细胞总数并检查细胞活力。一般来说，细胞存活率应达到90%~95%方可进行流式分析。如果用于凋亡检测，则需在染色后尽快完成检测，通常宜在1小时内完成。

在4℃下以约200g离心5分钟，弃上清后，在冰冷的悬浮缓冲液中重悬细胞沉淀。推荐的悬浮细胞浓度为0.5-1×10⁶个/mL。离心力和时间可能需要根据细胞类型进行优化——应充分离心以便去除上清液，但离心力不宜过大，以免细胞难以重悬。

注意：较高细胞浓度可能会堵塞流式细胞仪系统并影响分辨率。

死细胞容易与抗体发生非特异性结合，必须在分析时排除。活力染料（如7-AAD、DAPI等）无法穿透活细胞的完整细胞膜，只能对死细胞进行染色。

染色步骤：根据制造商说明，在4℃避光条件下用活力染料孵育细胞。选择发射光谱不与免疫染色所用荧光团重叠的染料。染色后，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次（200g离心5分钟，4℃），每次洗涤后重新悬浮沉淀。

注意：DAPI等活力染料不能用于固定细胞后的活/死染色，因为固定过程会损害所有细胞的细胞膜，导致假阳性。此时应使用胺反应性可固定细胞活力染料

将细胞重悬后，加入相应的荧光素偶联抗体，孵育后洗去未结合的抗体，用流式PBS重悬细胞于流式管中，即可上样分析。

防止细胞损伤：避免出现气泡、剧烈涡旋、更换缓冲液时吸出全部溶液以及过度离心

细胞染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时内完成-

将荧光团保存在黑暗中以避免光漂白

悬浮细胞在RNA提取中具有独特优势——无需胰酶消化，可直接离心收集，避免了消化过程对细胞状态的影响。

将细胞悬液转移至离心管中，室温下以1000 rpm离心6分钟，弃去上清。参考不同来源方法，也可采用12000 rpm 4℃离心2分钟收集细胞，之后用预冷的1×PBS清洗两次-。

对于悬浮细胞，可直接用吸管或移液枪吹打培养瓶壁，使细胞充分悬起，然后离心去上清，不需要用PBS提前洗涤-。随后加入Trizol裂解液，每5-10×10⁶个细胞加入1ml Trizol，反复用移液枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。

将混合好的样品全部移至1.5ml EP管中，室温静置5分钟。加入0.2ml氯仿（每1ml Trizol），盖好管盖，剧烈振荡（上下颠倒）15秒，室温静置2-3分钟。

2-8℃下以10500 rpm离心15分钟。此时样品分为三层：上层无色水相含RNA，中间层为蛋白质，下层有机相含DNA。小心取上层水相（约0.5-0.55ml）移至新的离心管中，注意不要触及中间界面。

在上清中加入等量的异丙醇，颠倒混匀5次，室温静置10分钟。2-8℃下以10500 rpm离心10分钟，弃上清，可见RNA沉淀于管底。

加入1ml75%乙醇洗涤沉淀，轻轻弹起管底，2-8℃下以8500 rpm离心5分钟，弃上清。

将EP管敞开放在滤纸上，管口朝向酒精灯方向，室温干燥（注意不要完-全干燥，否则RNA不易溶解）。用DEPC水溶解RNA（约30μl），分装后取2μl电泳检测完整性、2μl进行浓度测定，其余分装保存于-20℃备用。

l 防止RNase污染：全程戴好口罩和手套，使用无RNase的枪头、离心管等耗材

l 试剂安全：Trizol含有酚等有害物质，注意个人防护，操作应在通风良好的环境中进行

l 细胞裂解充分：确保移液管反复吹打直至细胞完-全溶解

l 避免DNA污染：相分离时切勿吸取中间蛋白层和有机相

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