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TECHNICAL ARTICLES
更新时间：2026-05-11
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在细胞培养中，无菌操作是决定实验成败的第一道防线。无论你的细胞系多么珍贵、培养基配方多么精准，一旦发生污染，所有努力都将归零。据统计，新手细胞培养失败的原因中，超过90%与无菌操作不当有关。本文将详细讲解超净工作台的标准使用流程、核心无菌操作技巧，以及污染识别与应急处理，助你建立一套可靠的无菌操作体系。
超净工作台（生物安全柜）是细胞培养的核心设备，它通过高效过滤器（HEPA）提供局部百级洁净环境。
l 灭菌：使用前，开启紫外灯照射至少30分钟。紫外灯可杀灭工作台表面及空气中的微生物。
l 通风：紫外灯关闭后，开启风机（通常调节至中速或高速），运行5-10分钟，排出臭氧并使台面形成稳定的层流。
l 清洁：用75%酒精喷洒或擦拭工作台面、内壁及移液器、废液缸等所有将要放入的物品表面。
注意：紫外灯对人眼和皮肤有伤害，操作前必须确认紫外灯已关闭。
2. 超净台分区使用原则
将超净台台面分为三个区域（以右手操作者为例）：
l 左侧（洁净区） ：放置未开封的培养基、胰酶、PBS、移液管等。
l 中央（操作区） ：进行细胞传代、加液等主要操作。
l 右侧（污染区） ：放置废液缸、使用过的移液管、污染的枪头等。
操作过程中，手和物品不可跨越洁净区到污染区，避免交叉污染。
l 穿着实验服，长发扎起，手腕以上不佩戴手表、首饰。
l 操作前用肥皂或洗手液彻-底洗手，再用75%酒精擦拭双手（尤其是指缝）。
l 必要时佩戴一次性无菌手套，但戴手套后仍需用酒精擦拭。
操作事项 | 正确做法 | 错误做法 |
物品传递 | 物品从侧面或上方移入，手臂不经过敞开容器上方 | 手臂横跨培养瓶瓶口 |
开盖方式 | 单手旋开瓶盖，瓶盖朝下或斜靠于手背，开盖后尽快操作 | 瓶口朝上敞开，或瓶盖内面朝下放台面 |
火焰使用 | 器皿口在酒精灯火焰10cm范围内（火焰无菌区）快速通过 | 瓶口离火焰太远，或长时间灼烧塑料制品 |
移液操作 | 移液管垂直插入液面下方，吸液后避免气泡；排出液体时贴壁或悬空轻放 | 移液管触碰瓶口外部 |
说话/咳嗽 | 避开超净台方向，佩戴口罩 | 正对超净台说话 |
3. 火焰无菌区的正确使用
许多实验室在超净台内放置酒精灯，火焰周围约10cm范围内形成热气流上升区，可防止空气中落菌。
操作技巧：
l 开盖后，将瓶口在火焰上快速灼烧1-2秒（玻璃瓶）或靠近火焰但不直接烧（塑料瓶）。
l 移液管从包装取出后，管口在火焰上过一下。
l 注意：酒精灯会升高局部温度，可能影响某些温度敏感试剂；使用无火焰灭菌器（红外线）更安全。
4. 减少污染的关键动作
l 动作慢而稳：快速移动会产生气流扰动，增加落菌风险。
l 手不触碰：移液管尖-端、瓶口内壁、培养皿内表面，任何可能接触细胞的地方，绝不可用手触碰。
l 及时盖盖：取用完毕后立即旋紧瓶盖，不要将所有瓶子同时打开。
即使遵守无菌操作，仍可能发生污染。以下是三种最常见的污染及判断方法：
污染类型 | 培养液外观 | 显微镜下特征 | 细胞状态 |
细菌污染 | 变浑浊、淡黄色、有沉淀 | 大量细小杆状或球状菌，运动活跃 | 细胞迅速死亡、脱落 |
真菌污染 | 变浑浊或出现白色絮状物（菌丝球） | 菌丝、孢子（酵母为卵圆形） | 细胞生长缓慢，逐渐死亡 |
支原体污染 | 培养液澄清（无明显变化） | 看不到菌体，但细胞形态异常、生长缓慢 | 细胞状态差，传代后不贴壁 |
快速检测法：
l 细菌/真菌：取培养液涂布LB平板或沙氏培养基，37℃培养24h看有无菌落。
l 支原体：需用PCR或荧光染色试剂盒检测（定期抽检）。
1. 轻度污染（早期发现）
如果细胞非常珍贵且污染不严重（如单个小菌落），可尝试用高浓度双抗（5-10倍正常浓度）处理24小时后换液。但成功率有限，不建议常规使用。
2. 严重污染
l 立即丢弃污染细胞及培养基，不要试图挽救。
l 彻-底消毒：
1. 用10%次氯酸钠（84消毒液）浸泡污染的培养瓶、移液管等。
2. 用75%酒精擦拭超净台内壁及所有可能接触过的物品（移液器、废液缸等）。
3. 开启紫外灯照射超净台30分钟以上。
4. 培养箱：用专用消毒剂（如季铵盐类）擦拭箱体内壁、水盘（水盘加入硫酸铜或专用抑菌剂）。
l 排查源头：检查PBS、胰酶、培养基是否污染（取少量接种至肉汤培养基培养）。如果多种试剂正常，则操作过程或培养箱空气可能是污染源。
3. 污染预防的额外措施
l 培养箱水盘定期更换无菌水并添加抑菌剂（如硫酸铜）。
l 每月对培养箱、超净台进行一次沉降菌检测（打开含琼脂的培养皿放置30分钟）。
l 新购入细胞株应隔离培养一段时间，确认无支原体后再与原有细胞共用试剂。
Q1：戴手套还需要用酒精擦手吗？
A：需要。手套在生产过程中可能残留粉尘或静电吸附颗粒，酒精擦拭可进一步消毒并减少颗粒脱落。
Q2：酒精灯火焰会烧到酒精棉吗？
A：会。绝对不可用酒精棉直接接触火焰。擦完酒精后等待10-15秒让酒精挥发，再靠近火焰。
Q3：超净台内可以同时放置多瓶培养基开盖吗？
A：不建议。每次只打开一瓶，用完立即盖好。多瓶同时开盖会极大增加污染风险。
Q4：超净台风机风向很重要吗？
A：非常重要。垂直层流超净台的风应从顶部吹向台面，不可有乱流。操作时手臂不应遮挡风口。
Q5：细胞培养箱需要定期灭菌吗？
A：需要。每1-2个月用专用的CO₂培养箱消毒剂（如过-氧化氢蒸汽）或75%酒精擦拭箱体内壁及隔板，然后通风去除残留。
无菌操作不是一项高深的技术，而是一套严谨的习惯。坚持“酒精勤擦、火焰速过、动作轻稳、随手盖盖"的十六字口诀，将无菌意识融入每一个操作细节，可以避免绝大多数污染。对于新手而言，前几次操作时放慢速度、反复确认每个步骤，比追求速度更重要。
柏莱源（天津）生物科技有限公司的优势:
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