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TECHNICAL ARTICLES
更新时间：2026-03-25
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从培养细胞中提取总蛋白是最基础的实验操作之一。但贴壁细胞与悬浮细胞因其生长状态不同，操作细节上有所差异。本文为两种细胞类型提供标准化操作流程（SOP），并汇总常见问题及解决方案。
1. 全程低温：所有操作在冰上或4℃条件下进行，缓冲液预冷。
2. 抑制剂现加：裂解液使用前立即加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如需）。
3. 裂解液选择：根据下游实验选择（如RIPA用于总蛋白WB，NP-40用于IP）。
4. 裂解液用量参考：
l 6孔板：120-150 μL/孔
l 12孔板：80-100 μL/孔
l 60 mm培养皿：300-400 μL
l 100 mm培养皿：500-800 μL
l 悬浮细胞（1×10⁷）：500-800 μL
1. 清洗：弃培养液，用预冷PBS轻柔清洗细胞3次，彻-底吸干残留液体。
2. 裂解：加入含抑制剂的裂解液，冰上孵育10-20分钟。期间每5分钟晃动培养皿，使裂解液覆盖均匀。
3. 收集：用预冷细胞刮快速刮下细胞，将裂解物转移至预冷离心管。
4. 离心：4℃下12,000-14,000 rpm离心20分钟。
5. 保存：取上清（即总蛋白），分装，-80℃保存。
关键要点：
l 避免胰酶消化：尽量用刮刀收集细胞，胰酶可能剪切膜蛋白并激活信号通路。
l 处理粘稠样品：若样品呈粘稠拉丝状（核酸污染），可在裂解后加入DNase I（10-20 U/mL，含2 mM Mg²⁺）冰上处理5分钟，显著降低粘度。
l 磷酸化蛋白：全程快速操作，从裂解到加入上样缓冲液变性应在30分钟内完成。
l 收集细胞：将细胞悬液转移至离心管，室温300-500×g离心5分钟，弃上清。
l 清洗：用预冷PBS重悬细胞，相同条件离心洗涤2次，弃上清，留下紧实细胞沉淀。
l 裂解：按细胞量加入冰冷裂解液，用移液器轻柔但充分吹打10-15次，重悬沉淀。
l 孵育：冰上孵育10分钟。对于难裂解细胞，可进行短时超声（1秒开/2秒停，共5-10次）。
l 离心：4℃下12,000-14,000×g离心10-15分钟。
l 保存：取上清，BCA定量后，加入上样缓冲液95℃变性5分钟，分装-80℃保存。
关键要点：
l 红细胞污染：若样本为血液或含红细胞，先用红细胞裂解液（RBC lysis buffer） 室温处理1-2分钟，离心弃上清后再进入洗涤步骤。
l 细胞量少：可适当减少裂解液体积以提高蛋白浓度。
l 颗粒物多：如浆细胞系，超声步骤不可少，能显著提高提取效率。
问题 | 可能原因 | 解决策略 |
蛋白浓度低 | 细胞量不足；裂解不充分；核酸干扰 | 增加起始细胞量；减少裂解液体积；加入超声步骤；延长裂解时间至20分钟 |
样品粘稠（拉丝） | DNA释放过多 | 加入DNase I（10-20 U/mL）并短暂孵育；增加一次高速离心 |
磷酸化信号丢失 | 磷酸酶未被抑制；操作时间过长 | 确保磷酸酶抑制剂新鲜且添加足量；30分钟内完成裂解至变性 |
样品起泡或降解 | 操作剧烈（涡旋）；未保持低温 | 轻柔吹打，避免涡旋；全程冰上操作 |
蛋白条带异常 | 蛋白降解 | 检查抑制剂是否失效；确保样品保存于-80℃且避免反复冻融 |
遵循标准化的SOP，根据细胞类型调整操作细节，并警惕常见问题，能极大提高蛋白提取的成功率和重复性。对于新手而言，从贴壁细胞使用RIPA裂解液开始是较为稳妥的选择，逐步积累经验后再优化条件。
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效期保障：严格把控产品质量，确保试剂效期新鲜，保障实验结果的可靠性。
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