TRIzol法提取RNA的详细步骤与关键注意事项

TRIzol法是RNA提取的金标准方法，由Chomczynski和Sacchi在1987年首-次描述，至今仍是实验室常用的技术之一。它基于酸性酚-异硫氰酸胍单相裂解系统，能高效裂解细胞并抑制RNase活性。本文将为您详细拆解TRIzol法提取RNA的每一步，并指出操作中的关键注意事项，助您成功获得高质量RNA。

实验前准备

样本：已处理好的组织匀浆或细胞裂解液（每50-100 mg组织或1×10⁷细胞加入1 mL TRIzol）。

试剂：氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free水。

耗材：RNase-free的1.5 mL离心管、枪头。

仪器：低温离心机、涡旋振荡器、移液器。

详细操作步骤与关键注意事项

第-步：相分离

将装有TRIzol裂解液的样品室温孵育5分钟，使核蛋白复合物完-全解离。

加入氯仿：按每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿的比例加入氯仿。

剧烈混匀：盖紧离心管盖，用手用力上下摇晃15秒，使溶液充分乳化为粉红色均一液体。

【关键点1】 ：切勿使用涡旋振荡器，涡旋可能导致DNA断裂并污染RNA。必须用手剧烈摇晃，确保两相充分接触。

【关键点2】 ：混匀不彻-底会严重影响RNA的得率和纯度。

室温孵育2-3分钟。

离心：4°C，12,000g，离心15分钟。

观察分层：离心后，混合物分为三层：

上层无色水相：含RNA（约占总体积的50-60%）。

中间白色相层：含DNA和蛋白质。

下层红色有机相：含蛋白质和酚。

第二步：RNA沉淀

小心吸取上层水相：用微量移液器，将枪头倾斜，小心穿过上层，沿管壁缓慢吸取上层水相，转移至一个新的RNase-free离心管中。

【关键点3】 ：务必不要吸取任何中间相物质。为防止DNA污染，即使牺牲一些回收率，也只吸取上层水相的80-90%（例如，1 mL TRIzol对应约600 μL水相，建议只吸500 μL）。

加入异丙醇：按每1 mL初始TRIzol用量，加入0.5 mL异丙醇。

混匀：上下颠倒离心管，充分混匀。

【关键点4】 ：混匀不彻-底会导致RNA无法有效沉淀。

室温孵育10分钟：

可选优化：对于微量RNA样品（<1 μg），可在此步加入1 μL糖原（20 mg/mL）作为载体，提高沉淀效率。为防止温度过高导致降解，也可在冰上或-20°C冰箱中进行沉淀。

第三步：RNA洗涤

离心：4°C，12,000g，离心10分钟。离心后，在管底或管侧可见白色凝胶状RNA沉淀。

弃上清：小心倒掉上清，或用移液器吸除，注意不要丢失沉淀。

加入75%乙醇洗涤：按每1 mL初始TRIzol用量，加入至少1 mL 75%乙醇。

悬浮沉淀：轻轻涡旋或上下颠倒，使沉淀脱离管壁，悬浮在乙醇中。

【关键点5】 ：这一步的目的是洗去残留的异丙醇和盐离子。必须确保沉淀被充分洗涤。

离心：4°C，7,500g，离心5分钟。

重复洗涤：弃上清，重复步骤3-5，共洗涤两次。

注意：沉淀在75%乙醇中非常稳定，可在2-8°C保存至少一周，或-20°C长期保存。

第四步：RNA溶解

弃尽乙醇：第二次洗涤离心后，小心倒掉上清，用微量移液器将管底残留的液体吸干。

干燥沉淀：打开管盖，室温空气干燥5-10分钟。

【关键点6】 ：切勿过度干燥。当沉淀由白色不透明变为半透明或透明胶状时，即为干燥完成。过度干燥的RNA极难溶解。

【关键点7】 ：切勿真空离心干燥，这会导致RNA不可逆地变性，溶解度大大降低。

溶解RNA：根据沉淀量，加入20-100 μL RNase-free水。

重悬：用移液枪反复吹打几次，使RNA充分溶解。如果RNA过于干燥，可在55-60°C水浴中温育10分钟助溶，但通常不建议加热，以免加速降解。

结果检测

取少量RNA溶液，使用紫外分光光度计测量浓度和纯度（A260/A280比值应在1.8-2.0之间），并用琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

柏莱源（天津）生物科技有限公司的优势:

现货供应：公司库存充足，可快速发货，减少用户等待时间。

效期保障：严格把控产品质量，确保试剂效期新鲜，保障实验结果的可靠性。

专业技术支持：提供详细的实验方案和技术指导，帮助用户优化实验条件，提高实验成功率。

定制化服务：根据用户需求，提供个性化的产品和服务解决方案。

售后保障：完善的售后服务体系，及时解决用户在使用过程中遇到的问题。