你了解免疫共沉淀 (Co-IP) 标准实验流程吗？

免疫共沉淀（Co-IP）是验证蛋白相互作用的经典技术，但实验操作对条件要求严苛，全程需保持非变性环境，任何一个步骤的疏漏都可能导致实验失败。本文整理了免疫共沉淀标准实验流程，从蛋白提取到蛋白洗脱全程手把手讲解，新手也能轻松上手。

实验前提：全程在 4℃冰箱或冰上操作，所有与样本接触的试剂、离心管、枪头均需提前预冷；裂解液、洗涤缓冲液中需加入新鲜的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解和磷酸化修饰丢失。

步骤 1：细胞 / 组织非变性裂解，提取可溶性蛋白复合物

1. 取培养至对数期的细胞（或预处理后的组织样本），用预冷的 PBS 轻轻洗涤 2 次，彻-底弃尽上清，避免残留 PBS 稀释裂解液；

2. 向样本中加入非变性裂解液（常用含 1% NP-40 或 Triton X-100 的裂解液），裂解液体积根据样本量调整（如 6cm 培养皿加 200-300μl）；

3. 冰上裂解 30min，期间每 10min 轻轻颠倒离心管一次，让裂解液与样本充分接触；

4. 4℃、12000rpm 离心 10min，吸取上清液至新的预冷离心管中，弃去底部的细胞 / 组织碎片沉淀；

5. 留取少量上清液作为Input 样品（阳性对照，验证目的蛋白正常表达），-20℃暂存备用。

步骤 2：预清除处理，降低非特异性结合（关键步骤）

向提取的蛋白上清液中加入无抗体偶联的对照树脂 / 磁珠（蛋白 A/G 磁珠），4℃缓慢摇床孵育 30min；磁珠会吸附裂解液中的杂蛋白、细胞碎片等易产生非特异性结合的物质，孵育后通过磁力架吸附磁珠，将上清液转移至新的预冷离心管中，弃去吸附了杂蛋白的磁珠。
✅ 这一步是减少实验假阳性、降低背景的核心，不可省略。

步骤 3：抗体孵育，形成可溶性抗体 - 蛋白复合物

1. 将预清除后的上清液平均分为实验组和IgG 对照组（两组体积一致，排除抗体非特异性结合）；

2. 实验组加入适量诱饵蛋白的特异性抗体（常规用量 1-5μg / 样本，根据抗体效价调整），IgG 对照组加入等量的同物种非特异性 IgG；

3. 两组均在 4℃缓慢摇床孵育 2-4h，若诱饵蛋白丰度低，可孵育过夜，提高抗体与诱饵蛋白的结合效率。

步骤 4：固相载体孵育，富集蛋白复合物

向实验组和 IgG 对照组中分别加入预冷的蛋白 A/G 琼脂糖珠 / 磁珠，4℃缓慢摇床孵育 2-4h；蛋白 A/G 会特异性结合抗体的 Fc 段，形成 “磁珠 - 蛋白 A/G - 抗体 - 诱饵蛋白 - 互作蛋白" 的固相复合物，完成蛋白沉淀的核心过程。

步骤 5：多次洗涤，去除未结合的杂蛋白

1. 孵育结束后，通过磁力架吸附磁珠，弃去上清液，保留磁珠复合物；

2. 向磁珠中加入预冷的洗涤缓冲液（去污剂浓度降至 0.1%，保护蛋白复合物不解离），轻轻涡旋混匀后，磁力架吸附磁珠并弃去上清；

3. 重复洗涤 3-5 次，若实验背景过高，可增加至 5 次；最后-次洗涤后，用微量枪头吸尽离心管底部残留的洗涤缓冲液，避免稀释后续样品。
✅ 洗涤时动作轻柔，切勿吸走磁珠，防止目的蛋白丢失。

步骤 6：蛋白洗脱，获得目的蛋白复合物

向洗涤后的磁珠复合物中加入 2×SDS 上样缓冲液，涡旋混匀后，95℃金属浴加热 5-10min，使蛋白从磁珠 - 抗体复合物中洗脱并变性；加热后短暂离心，吸取上清液，即可用于后续的 Western Blot（WB）验证或质谱（MS）鉴定。
遵循上述标准化流程，并结合预实验优化抗体用量和洗涤条件，您将能稳定地获得高质量的免疫共沉淀数据，为蛋白质功能研究提供可靠依据。

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