制备高效感受态细胞的注意事项有哪些？

在基因克隆、蛋白表达等分子生物学实验中，感受态细胞的质量直接决定了外源DNA的转化效率。无论你是采用经典的CaCl₂法，还是追求高产量的Inoue法，制备过程中的细节把控都至关重要。本文将深度解析制备高效感受态细胞的核心注意事项，帮助你的实验效率提升10倍以上。

一、 菌株选择与培养状态：高转化率的起点

1. 选择合适的受体菌株

不是所有细菌都适合制备感受态。实验室常用的DH5α、JM109、TO-P10等菌株通常为限制-修饰系统缺陷的突变株，不会切割外源DNA 。如果是用于蛋白表达，应选用BL21(DE3)等表达菌株 。菌株特性与载体的匹配度也会影响最终结果。

2. 严格控制生长密度（OD600）

细胞的生长状态是核心变量。

最佳时机：应在细菌处于对数生长期（Log phase） 收获。通常控制OD600在0.4-0.6之间（具体视菌株而定，如TG1在OD600=0.5时密度约5×10⁷个/mL）。

密度陷阱：密度过低（<0.3）则菌量不足；密度过高（>0.8）会导致细菌衰老，细胞壁通透性变差，转化率急剧下降 。

培养温度：Inoue法推荐在18-25℃低温培养，这有助于维持细胞膜的最-佳状态，尤其适用于制备超高效感受态 。

3. 接种策略

新鲜活化：不要使用保存于4℃或多次传代的菌液，应从-80℃保存的甘油菌中直接在平板上划线，挑取新鲜单菌落（直径1-3毫米）进行活化 。

培养基选择：使用SOB或SOC培养基通常比普通LB培养基能获得更高效率的感受态，因其富含Mg²⁺等离子 。

二、 关键操作细节：低温与轻柔是生命线

1. 全程严格低温

从菌液收获那一刻起，温度控制即决定成败。

骤停生长：培养液需立即冰浴10-30分钟，停止细菌生长 。

预冷器械：所有接触菌体的物品——离心管、CaCl₂溶液、离心机转子，都必须4℃预冷 。

操作时限：整个制备过程应尽可能在低温环境中快速完成，避免离开冰浴 。

2. 离心力与重悬的温柔法则

细菌细胞壁虽然坚固，但在处理过程中变得脆弱。

离心力控制：离心力过大易损伤细胞。建议使用低温低速离心（如4℃，1500g-4000g，5-10分钟）。Inoue法特别强调不超过2500g 。

轻柔重悬：加入缓冲液后，禁止涡旋震荡！应使用移液枪轻轻吹打或用指尖弹击管底使菌体悬浮。粗暴操作会导致细胞破裂或产生碎片，降低转化率 。

3. 试剂纯度与离子浓度

高纯试剂：所用的CaCl₂、MnCl₂、DMSO等试剂须为分析纯及以上，用超纯水（18.2 MΩ·cm） 配制 。

DMSO的使用：在Inoue法中，最后加入DMSO（终浓度7%）可保护细胞膜，但DMSO需高纯且低温加入，轻轻混匀后静置 。部分商业试剂盒甚至不需要液氮处理 。

三、 环境与无菌控制：杜绝隐形污染

1. 无菌与无杂DNA

环境要求：虽然部分步骤在超净台外操作（如离心），但所用器具（枪头、离心管）必须高压灭菌且最-好为全新 。

防止污染：避免被DNA酶或杂DNA污染。即使是微量的DNA酶也会降解后续用于转化的质粒 。

2. 洁净优于无菌？

有经验表明，在高效感受态制备中，洁净度比无菌更重要。因为后期会加入DMSO等抗冻剂，且最终在-80℃保存，极-端的无菌环境有时被“洁净操作"替代，但所有接触菌体的液体仍需严格灭菌 。

四、 分装与保存：锁住高效瞬间

1. 速冻保存

制备好的感受态细胞若不立即使用，需进行长期保存。

分装规格：通常按50-100μL/管分装，避免反复冻融 。

速冻方法：

1．液氮速冻：传统高效法，将分装好的EP管投入液氮中急冻，然后转移至-80℃冰箱 。

2．-80℃保存：某些改良缓冲液（如含优化甘油的TB缓冲液）允许直接放入-80℃冰箱，无需液氮 。

2. 保存期限

在-80℃条件下，高效感受态一般可保存6个月至1年，但随着时间推移转化效率会下降 。

五、 方法对比：选择适合你的策略

六、总结

制备高效感受态细胞是一场与时间和温度的赛跑。核心口诀是：“菌要年青（对数期），温要低（4℃冰浴），手要轻（勿吹打），质要纯（无菌/高纯试剂）。" 只要把控好上述每一个环节，即使是初学者也能制备出转化效率高达10⁸以上的优质感受态细胞，为后续的克隆实验打下坚实基础。如需了解更多细胞生物学实验技巧，欢迎继续关注我们的内容更新。

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