你了解大肠杆菌化学法感受态细胞制备实验流程吗？

CaCl₂化学法是大肠杆菌感受态细胞制备的经典方法，因操作简便、成本低、适用性广，成为分子生物学基础实验的标准方法。该方法的核心是严格控制低温环境和细菌生长状态，确保细胞膜通透性改变的同时维持细胞活力，以下为该方法的完整材料准备和分步骤操作流程，实验全程需遵循无菌操作原则。

一、实验材料准备（提前预冷，无菌处理）

1. 菌株：大肠杆菌标准菌株（如 DH5α，为限制酶和甲基化酶缺失菌株，转化效率更高）

2. 培养基：无菌 LB 液体培养基

3. 试剂：预冷至 4℃的 0.1 M CaCl₂溶液、预冷至 4℃的含 15% 甘油的 0.1 M CaCl₂溶液（甘油为冻存保护剂，防止细胞冻融损伤）

4. 实验设备：恒温摇床、4℃冷冻离心机、无菌移液器、无菌微量离心管、接种环、冰浴装置 / 冰块

5. 其他：无菌工作台（用于无菌操作）、-80℃超低温冰箱（用于感受态细胞储存）

二、完整实验操作步骤

步骤 1：种子培养（获得活化的菌种）

在无菌工作台中，用接种环从大肠杆菌新鲜平板上挑取单个菌落，接种至含有 5 mL 无菌 LB 培养基的试管中；将试管置于 37℃恒温摇床，200 rpm 转速过夜培养（约 16 h），确保菌种充分活化。

步骤 2：扩大培养（控制细菌至对数生长期）

取 1 mL 活化后的菌液，加入到含有 50 mL 新鲜无菌 LB 培养基的锥形瓶中，继续在 37℃、200 rpm 条件下振荡培养；实时监测菌液 OD600 值，当数值达到0.4-0.6时立即停止培养（此阶段为细菌对数生长期，细胞膜状态最-佳，转化效率-最-高），该过程通常需要 2-3 h。

步骤 3：冷却处理（降低细胞代谢速率）

将培养好的菌液锥形瓶迅速转移至冰浴装置中，冰浴冷却 10 min，快速降低细菌代谢速率，为后续细胞膜处理做准备，此步骤需保证冷却迅速，避免细菌继续生长。

步骤 4：首-次收集细胞（离心获得细菌沉淀）

将冷却后的菌液转移至无菌离心管中，在 4℃低温环境下，以 4000 rpm 转速离心 10 min，使细菌细胞充分沉降；离心完成后，小心弃去上清液，注意不要触碰管底的细菌沉淀。用预冷的 0.1 M CaCl₂溶液轻轻重悬细胞沉淀，避免剧烈搅拌或吹打，防止损伤细菌细胞膜。

步骤 5：洗涤细胞（去除培养基残留，强化钙离子作用）

将重悬后的菌液再次在 4℃、4000 rpm 条件下离心 10 min，收集细胞沉淀；重复用预冷的 0.1 M CaCl₂溶液重悬 - 离心的操作一次，彻-底去除残留的 LB 培养基成分，保证钙离子与细胞膜的充分结合，提升后续转化效率。

步骤 6：最终重悬与分装（冻存备用）

用适量预冷的含 15% 甘油的 0.1 M CaCl₂溶液轻轻重悬最终的细胞沉淀，根据实验需求调整菌液体积（常规为每管 100 μL）；将分装好的感受态细胞迅速转移至 - 80℃超低温冰箱中储存备用，冻存后的感受态细胞可在较长时间内保持转化活性。

三、转化效率的关键控制点

四、常见问题与解答

Q1：OD600超过0.6还能用吗？

不建议使用，菌体过密会影响细胞膜状态，降低转化效率。

Q2：感受态细胞可以反复冻融吗？

不可以。反复冻融会严重损伤细胞膜，导致转化效率急剧下降。

Q3：如何验证制备的感受态细胞是否有效？

感受态细胞活性检测：可以用已知浓度的质粒（如 10 pg/μL 的 pUC19）进行梯度转化，计算转化效率（转化子数 /μg DNA），优质的感受态细胞转化效率应≥10⁶ CFU/μg。 质粒用量优化：对于常规质粒（如 3 kb 左右），50 μL 感受态细胞使用 10 - 50 ng 质粒即可，过多的质粒可能会导致转化率下降。

五、总结

掌握CaCl₂化学法制备大肠杆菌感受态细胞的操作流程，是分子生物学实验的基本功之一。通过严格把控菌体生长状态、温度控制和无菌操作，实验人员可以稳定获得高效转化的感受态细胞，为后续的基因克隆、蛋白表达等实验打下坚实基础。如需了解更多分子生物学实验技巧，欢迎继续关注我们的内容更新。
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