欢迎进入柏莱源(天津)生物科技有限公司网站!
13302035784
技术文章

TECHNICAL ARTICLES

当前位置:首页  -  技术文章  -  PCR体系及各类常见PCR辨析

PCR体系及各类常见PCR辨析

更新时间:2023-11-06点击次数:353

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR,是一种体外高效扩增特定DNA片段的分子生物学技术。该技术的发明人是Kary Mullis,他从1983年开始研究PCR技术,1985年开始被逐渐采用,成为分子生物学的一项常规手段,并得到了广泛的应用,在临床诊断、生物医学研究和法医学领域都具有重要意义。PCR是在体外模拟体内DNA复制的过程,它用加热的办法让需要扩增的DNA片段变性解链成两条单链,人工合成的一对引物让它们结合到DNA模板(分别结合到两条链上)的两端,DNA聚合酶即可以大量复制该模板。了解了PCR的基本过程,再一起来学习一下PCR体系及各类常见PCR辨析吧!

PCR体系

1. 模板

需要研究或扩增的目的核酸分子,DNA可以直接扩增,RNA需要增加一步逆转录,或者在体系中加逆转录酶一步法进行RT-PCR扩增;

2. 引物

良好设计的引物,是扩增特异性及扩增效率的关键因素之一;

3. Taqase

PCR体系的核心组分,Taqase的性能,直接决定了扩增体系能否达到实验要求;

针对不同类型的模板、特异性的要求、产物保真度的要求、扩增产物的长度,需要选用能满足对应要求的Taqase;所选用的酶如果不匹配,实验是无法成功的;

对一株Taqase的性能评价,主要是如下几个方面:扩增效率,扩增速度,保真度,除了催化链延伸之外的其它活性,抗逆性等;

4. dNTP

dNTP的浓度和质量,也是影响扩增产率的一个重要因素;dNTP分子中,含有一个高能磷酸键,是影响dNTP稳定性的关键因素,高能磷酸键的断裂也是造成dNTP质量不合格的分子层面的原因;

5. Buffer

为PCR反应体系提供稳定的工作环境,主要环境因素为pH值,离子强度等;

6. Mg++

因为镁离子对Taqase活性影响大,所以一般buffer之外,还单独带一管Mg++,方便用户灵活调节体系里面Mg++浓度;

除了上述六种必要的组分之外,还有较多的工具蛋白或者小分子化合物,能对PCR体系起到相应的作用,这方面累积的研究成果也比较多。

各类常见PCR辨析

1. PCR,通常指的是普通PCR,以双链DNA为模板,以dNTP为底物,大量(30个循环理论上可以使产物增加到模板初始摩尔数的10的9次方倍)扩增双链DNA。产物通常以电泳及凝胶成像方式来分析。

2. qPCR和Real-time PCR,指的是实时荧光定量PCR,以DNA或cDNA为模板,以dNTP为底物,以荧光基团为报告分子,收集荧光信号从而对扩增出的DNA进行定量分析。为避免和RT-PCR(逆转录PCR)混淆,现在一般不太常用real-time PCR,通常交流,用qPCR指代更明确。

3. RT-PCR,指的是逆转录PCR,以由mRNA逆转录成的cDNA为模板,以dNTP为底物,进行DNA的扩增及检测。

4. RT-qPCR,指的是实时荧光定量逆转录PCR,是qPCR+RT-PCR的组合,将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板,以dNTP为底物,进行产物的定量分析。

507c24d3c823966d605e2e732fa4b8bd.png




2473262194

TEL:13302035784

微信咨询