PCR体系及各类常见PCR辨析

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是一种体外高效扩增特定DNA片段的分子生物学技术。该技术的发明人是Kary Mullis，他从1983年开始研究PCR技术，1985年开始被逐渐采用，成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的应用，在临床诊断、生物医学研究和法医学领域都具有重要意义。PCR是在体外模拟体内DNA复制的过程，它用加热的办法让需要扩增的DNA片段变性解链成两条单链，人工合成的一对引物让它们结合到DNA模板（分别结合到两条链上）的两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。了解了PCR的基本过程，再一起来学习一下PCR体系及各类常见PCR辨析吧！

PCR体系

1. 模板

需要研究或扩增的目的核酸分子，DNA可以直接扩增，RNA需要增加一步逆转录，或者在体系中加逆转录酶一步法进行RT-PCR扩增；

2. 引物

良好设计的引物，是扩增特异性及扩增效率的关键因素之一；

3. Taqase

PCR体系的核心组分，Taqase的性能，直接决定了扩增体系能否达到实验要求；

针对不同类型的模板、特异性的要求、产物保真度的要求、扩增产物的长度，需要选用能满足对应要求的Taqase；所选用的酶如果不匹配，实验是无法成功的；

对一株Taqase的性能评价，主要是如下几个方面：扩增效率，扩增速度，保真度，除了催化链延伸之外的其它活性，抗逆性等；

4. dNTP

dNTP的浓度和质量，也是影响扩增产率的一个重要因素；dNTP分子中，含有一个高能磷酸键，是影响dNTP稳定性的关键因素，高能磷酸键的断裂也是造成dNTP质量不合格的分子层面的原因；

5. Buffer

为PCR反应体系提供稳定的工作环境，主要环境因素为pH值，离子强度等；

6. Mg++

因为镁离子对Taqase活性影响大，所以一般buffer之外，还单独带一管Mg++，方便用户灵活调节体系里面Mg++浓度；

除了上述六种必要的组分之外，还有较多的工具蛋白或者小分子化合物，能对PCR体系起到相应的作用，这方面累积的研究成果也比较多。

各类常见PCR辨析

1. PCR，通常指的是普通PCR，以双链DNA为模板，以dNTP为底物，大量（30个循环理论上可以使产物增加到模板初始摩尔数的10的9次方倍）扩增双链DNA。产物通常以电泳及凝胶成像方式来分析。

2. qPCR和Real-time PCR，指的是实时荧光定量PCR，以DNA或cDNA为模板，以dNTP为底物，以荧光基团为报告分子，收集荧光信号从而对扩增出的DNA进行定量分析。为避免和RT-PCR（逆转录PCR）混淆，现在一般不太常用real-time PCR，通常交流，用qPCR指代更明确。

3. RT-PCR，指的是逆转录PCR，以由mRNA逆转录成的cDNA为模板，以dNTP为底物，进行DNA的扩增及检测。

4. RT-qPCR，指的是实时荧光定量逆转录PCR，是qPCR+RT-PCR的组合，将总RNA或mRNA逆转录成cDNA后再作为模板，以dNTP为底物，进行产物的定量分析。